微小RNA-133a-5p在丙泊酚防治大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用及作用機(jī)制

郝偉，范惟，王佳妮，王超

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，呼和浩特 010017

缺血再灌注（I/R）損傷是肝臟創(chuàng)傷治療、肝切除和肝移植過(guò)程中不可避免的病理生理學(xué)過(guò)程，通常會(huì)引起創(chuàng)傷性失血性休克、肝臟損傷或移植功能障礙[1］。肝臟I/R損傷的確切機(jī)制尚未明確，微循環(huán)功能障礙、氧化應(yīng)激反應(yīng)及鈣超載等機(jī)制可能在肝臟I/R損傷中發(fā)揮重要作用。有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPKs）是參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號(hào)通路[7］。有絲分裂原激活的蛋白激酶6（MAPK6）是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）途徑中的重要組成蛋白，也是細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)的關(guān)鍵媒介。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類小的非編碼RNA，可能是肝臟I/R損傷重要的調(diào)節(jié)因子。微小RNA-133a（miR-133a）在心肌細(xì)胞形成、心臟發(fā)育和心肌I/R損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[10］發(fā)現(xiàn)，肝癌組織、細(xì)胞中miR-133a表達(dá)下調(diào)，且miR-133a 能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。我們前期研究[2］發(fā)現(xiàn)，MAPK6 是miR-133a-5p 的一個(gè)作用靶點(diǎn)。既往研究[3］發(fā)現(xiàn)，多種麻醉藥物可減輕肝臟的I/R 損傷。丙泊酚（2，6-二異丙基苯酚）是一種快速、短效的全身麻醉藥物，具有抗氧化作用，對(duì)心臟、腎臟和肝臟I/R 損傷均有防治作用。但目前丙泊酚在肝臟I/R 損傷中的具體作用機(jī)制尚不明確。為此，我們觀察了miR-133a-5p 在丙泊酚防治大鼠肝臟I/R 損傷中的作用，并進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、試劑及儀器 純系雄性清潔級(jí)健康SD 大鼠42 只，體質(zhì)量為200～250 g，由內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物均按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，晝夜12 h交替，進(jìn)食飲水不受限制。手術(shù)前12 h進(jìn)行禁食但飲水自由。所有對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作符合由中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用手冊(cè)》。人源正常肝臟細(xì)胞系QSG-7701 購(gòu)自于美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。丙泊酚購(gòu)自Sigma-Aldrich（中國(guó)上海）。抗MAPK6 和b-actin抗體購(gòu)自Cell Signalling Technology（Boston， MA）。MiR-133a-5p mimic、miR-133a-5p 抑制劑和相應(yīng)的對(duì)照物均購(gòu)自Ribobio（中國(guó)廣州）。

1.2 丙泊酚對(duì)I/R大鼠肝功能及肝組織miR-133a-5p、MAPK6 mRNA表達(dá)影響觀察

1.2.1 大鼠分組、肝臟I/R 模型構(gòu)建 取18 只大鼠，分為丙泊酚組、模型組及對(duì)照組，每組6 只。腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，將其固定于消毒手術(shù)臺(tái)上氣管插管并使用正壓呼吸機(jī)，暴露大鼠腹部，在腹部正中間位置傷口最小化剖腹并將肝周圍韌帶離斷使肝門區(qū)充分暴露。將大鼠肝臟左葉、中葉的肝門三管系統(tǒng)（動(dòng)脈、靜脈和膽管）分離，用微創(chuàng)動(dòng)脈血管夾將分離的脈管夾閉以阻斷血液供給（缺血），l mL 生理鹽水腹腔注射補(bǔ)充流失體液和血液，取4-0的黑色絲線縫合腹部切口。缺血60 min（缺血）后移除微創(chuàng)動(dòng)脈血管夾恢復(fù)供血（再灌注），黑色絲線縫合傷口，并覆上傷口貼。丙泊酚組在缺血再灌注操作的同時(shí)注射丙泊酚0.6 mg/（kg·min）。對(duì)照組不做任何處理，除不用微創(chuàng)動(dòng)脈血管夾將肝臟中葉及左葉血管夾閉以外，其余手術(shù)步驟與其余兩組大鼠一致。

1.2.2 三組大鼠血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測(cè) 再灌注結(jié)束時(shí)，采集大鼠下腔靜脈血4 mL，4 000 r/min離心12 min，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.2.3 三組大鼠肝組織miR-133a-5p 及MAPK6 mRNA 檢測(cè) 采血后用斷頭法將大鼠處死將大鼠肝臟缺血組織分離。采用qRT-PCR 法檢測(cè)三組大鼠肝組織miR-133a-5p、MAPK6 mRNA。用TRIzol試劑（Invitrogen， CA， USA）分離組織和細(xì)胞的總RNA。為了確定miR-133a-5p， 使用 miRNA 專用引物和Taqman MicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 Taqman miRNA 檢測(cè)試劑（Applied Biosystems） 進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR（qPCR）分析。被用作miRNA水平數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部參考。所有操作均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)SYBR Green RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，miRNA及MAPK6 mRNA分別以RNU6B、GAPDH為內(nèi)參，具體步驟及條件參考文獻(xiàn)[7］。以2-ΔΔCt代表miR-133a-5p、MAPK6 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.3 miR-133a-5p 抑制劑聯(lián)合丙泊酚對(duì)I/R 大鼠肝功能及肝組織miR-133a-5p、MAPK6mRNA 表達(dá)的影響觀察

1.3.1 大鼠分組、模型構(gòu)建及丙泊酚和miR-133a-5p抑制劑給予方法 另取24只大鼠分為甲、乙、丙、丁組，每組6 只。四組均對(duì)肝臟進(jìn)行缺血再灌注操作，甲組在缺血再灌注操作的同時(shí)肝臟注射丙泊酚0.6 mg/（kg·min）及miR-133a-5p 抑制劑，乙組、丙組在缺血再灌注操作的同時(shí)肝臟注射丙泊酚0.6 mg/（kg·min）、丙泊酚+等量生理鹽水，丁組不做任何處理。

1.3.2 各組大鼠血清AST 及ALT、肝組織MAPK6 mRNA 檢測(cè) 在灌注結(jié)束時(shí)，采集大鼠下腔靜脈血4 mL，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST。采血后用斷頭法將大鼠處死，分離肝臟組織，采用qRT-PCR 法檢測(cè)三組大鼠肝組織MAPK6 mRNA。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)性分析采用 Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)； 不符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量用中位數(shù)和四分位間距表示，兩組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻率和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血清AST、ALT 活性比較 丙泊酚組、模型組及對(duì)照組大鼠血清AST 分別為（312 ±73）、（1 210 ± 173）、（45 ± 5）μ/L， ALT分別為（616 ±185）、（1 711 ± 201）、（207 ± 28）μ/L。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT 活性升高（P均＜0.01）；與模型組比較，丙泊酚組大鼠血清AST、ALT活性降低（P均＜0.05）。

2.2 三組大鼠肝臟組織miR-133a-5p、MAPK6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 丙泊酚組、模型組及對(duì)照組大鼠肝臟組織miR-133a-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.94 ± 0.08）、（0.43 ± 0.12）、（1 ± 0），丙泊酚組、模型組及對(duì)照組大鼠肝臟組織MAPK6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.56 ± 0.23）、（2.76 ± 0.43）、（1 ± 0）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟組織miR-133a-5p相對(duì)表達(dá)量降低、MAPK6mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高（P均＜0.01）；與模型組比較，丙泊酚組大鼠肝臟組織miR-133a-5p相對(duì)表達(dá)量升高、MAPK6mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P均＜0.01）。

2.3 四組大鼠血清ALT、AST 水平及MAPK6 表達(dá)比較 甲乙丙丁四組大鼠血清ALT 分別為（1 701 ±103）、（503 ± 127）、（525 ± 131）、（1 231 ± 125） μ/L；AST 分 別 為（1 150 ± 104）、（206 ± 76.0）、（215 ±83.0）、（1 051 ± 210）μ/L；肝組織MAPK6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1 ± 0、0.41 ± 0.12、0.34 ± 0.07、0.93 ± 0.06。與甲組比較，乙組大鼠血清ALT 和AST 水平及肝組織MAPK6mRNA 相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.01）；與乙和丙組比較，丁組大鼠血清ALT 與AST 水平、肝組織MAPK6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均升高（P均＜0.01）。

3 討論

丙泊酚是一種快速和短效的麻醉劑，其結(jié)構(gòu)與a-生育酚相似，顯示出對(duì)肝臟 I/R 損傷的防治作用。由于這一特性，研究集中在丙泊酚對(duì)I/R 損傷的影響。丙泊酚可以防止腦I/R 損傷的大鼠在缺氧和缺葡萄糖后自噬細(xì)胞死亡[11］。在肝臟 I/R損傷的家兔模型中，丙泊酚緩解了肝臟中的竇道充血、細(xì)胞質(zhì)空泡化和肝細(xì)胞壞死[12］。據(jù)報(bào)道，丙泊酚可以通過(guò)增加肝臟血流來(lái)維持肝臟的氧平衡，以補(bǔ)償增加的氧消耗。丙泊酚還可以通過(guò)維持線粒體功能來(lái)保護(hù)肝臟免受I/R 損傷，這與MPTP 和GSK-3b 的調(diào)節(jié)有關(guān)[13］。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)丙泊酚對(duì)肝臟I/R損傷有防治作用。本研究中，丙泊酚明顯降低了肝臟I/R 損傷大鼠體內(nèi)的血清AST 和ALT 的水平。此外，丙泊酚可防止I/R 誘導(dǎo)的miR-133a-5p 的減少，并降低肝I/R 損傷大鼠和暴露于H/R 的肝細(xì)胞中MAPK6 的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-133a-5p 逆轉(zhuǎn)了丙泊酚對(duì)肝臟I/R 損傷大鼠的防治作用，證明miR-133a-5p 和MAPK6 可能在某種程度上參與了丙泊酚對(duì)肝臟I/R損傷的防治作用。

本研究設(shè)計(jì)通過(guò)測(cè)定miR-133a-5p及MAPK6水平，闡明丙泊酚的保護(hù)性分子機(jī)制。miR-133a-5p是miR-1/miR-133 miRNA 簇的成員。miR-133a的過(guò)量表達(dá)可能通過(guò)靶向蛋白激酶2 來(lái)抑制I/R 損傷介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，表明了miR-133a 可能是缺血性心臟病的潛在治療方法[14］。在本研究中，miR-133a-5p在肝臟I/R 損傷大鼠的肝臟組織中被下調(diào)，這被丙泊酚所逆轉(zhuǎn)。

MAPK6 被認(rèn)為是一個(gè)細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)的關(guān)鍵媒介，可被冷應(yīng)激、干旱應(yīng)激、創(chuàng)傷應(yīng)激或氧化應(yīng)激激活。ZHANG 等[15］報(bào)道，ERK3 在氧化應(yīng)激的早期階段被H2O2上調(diào)。本研究中發(fā)現(xiàn)miR-133a-5p 可以調(diào)節(jié)大鼠肝臟組織中MAPK6 的表達(dá)。丙泊酚保護(hù)肝臟免受I/R 損傷，與miR-133a-5p 和 MAPK6 的調(diào)控有關(guān)，可能為今后開(kāi)發(fā)肝臟I/R 損傷的診斷和治療策略提供有用的線索。

綜上所述，丙泊酚能減輕肝臟I/R 大鼠的肝損傷、促進(jìn)肝臟組織miR-133a-5p 表達(dá)，抑制肝組織MAPK6 mRNA 表達(dá)。抑制miR-133a-5p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)肝臟I/R 大鼠肝損傷的防治作用，丙泊酚可能通過(guò)調(diào)控肝臟組織miR-133a-5p 表達(dá)，進(jìn)一步抑制肝組織MAPK6mRNA 表達(dá)，減輕大鼠的肝臟I/R損傷。