miR-181a-5p在ACS患者血清中表達(dá)及對人HCASMC細(xì)胞增殖遷移的調(diào)控作用、與ADAMTS1靶向關(guān)系

顎璐莎，易華，張艷芳

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，呼和浩特 010017；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院病理科

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是世界范圍內(nèi)常見的心血管疾病，主要包括急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）和不穩(wěn)定心絞痛（unstable angina pectoris，UAP），冠狀動脈粥樣硬化是其病理學(xué)基礎(chǔ)[1］。近年來ACS 發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，是造成冠心病患者病死率升高的主要病因[2］。目前ACS 患者冠狀動脈粥樣斑塊及不穩(wěn)定性狀態(tài)的形成機(jī)制尚未完全明確，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及炎癥反應(yīng)可能是冠狀動脈粥樣斑塊形成及影響斑塊穩(wěn)定性的主要因素[3］。最新研究[4-5］發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）在ACS 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，參與調(diào)控動脈粥樣硬化斑塊的形成及穩(wěn)定性。微小RNA-181a-5p（miR-181a-5p）屬于miRNA 家族成員，其在細(xì)胞增殖、分化、遷移等多種生理病理過程中起著 極 其 重 要 的 作 用[6］。近 期 動 物 實(shí) 驗(yàn)[7］發(fā) 現(xiàn)，miR-181a-5p在動脈粥樣硬化ApoE-/-模型小鼠動脈粥樣硬化斑塊和血漿中表達(dá)均明顯降低，上調(diào)miR-181a-5p表達(dá)能夠延緩動脈粥樣硬化ApoE-/-模型小鼠粥樣斑塊的形成，增加斑塊的穩(wěn)定性。但目前miR-181a-5p在ACS中的研究甚少，并且其對冠狀動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的作用尚不明確。血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶1（ADAMTS1）是一種分泌性蛋白酶，已有研究發(fā)現(xiàn)其與動脈粥樣硬化關(guān)系密切，與斑塊的形成及不穩(wěn)定性密切相關(guān)[8］。近期研究[9］發(fā)現(xiàn)，ADAMTS1的3'UTR區(qū)上有miR-181a-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，ADAMTS1基因可能是miR-181a-5p的下游作用靶基因。但至今miR-181a-5p 在ACS 中作用的下游分子機(jī)制是否與其對ADAMTS1 基因的靶向作用有關(guān)尚不清楚。為此，我們觀察了miR-181a-5p 在ACS 患者血清中表達(dá)及對人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移調(diào)控作用，進(jìn)一步探討其與ADAMTS1的靶向關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞系HCASMC 購自美國Lifeline公司，采用DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)，2～3 d 傳代一次，取第4 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。TRIzol 試劑購自北京天根公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；血清miRNA提取試劑盒購自美國Ambion 公司；miR-181a-5p 模擬物（miR-181a-5p mimics）、模擬物陰性對照（mimics-NC）、miR-181a-5p 抑制物（miR-181a-5p inhibitor）、抑 制物 陰 性對 照（inhibitor-NC）及 突變 型ADAMTS1 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)（ADAMTS1-MUT）、野生型ADAMTS1 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（ADAMTS1-WT）均購自上海吉瑪制藥公司；qRT-PCR 相關(guān)引物購自廣東銳博生物公司；CCK-8檢測試劑盒購自武漢博士德公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒購自日本TaKaRA 公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega 公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自美國Thermo 公司；兔抗人ADAMTS1 單克隆抗體購自美國CST公司。

1.2 ACS患者血清miR-181a-5p表達(dá)觀察

1.2.1 臨床資料 選擇2021 年5 月—2023 年5 月在我院心內(nèi)科住院治療并行冠脈造影的100 例ACS患者，其中男62 例、女38 例，年齡（55.6 ± 6.8）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國心臟病學(xué)會/美國心臟協(xié)會（ACC/AHA）發(fā)布的心血管診療指南標(biāo)準(zhǔn)；②年齡＞18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期接受過支架置入、冠狀動脈溶栓或搭橋手術(shù)的患者；②合并有肝腎功能不全、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等嚴(yán)重疾病；③合并有急慢性感染、急性腦卒中等；④患者均對本研究知情同意。100 例ACS 患者中AMI 患者55 例、UAP 患者45例。同期收集40例我院心內(nèi)科行冠脈造影結(jié)果陰性者為對照組，其中男26 例、女14 例，年齡（54.9 ±7.7）歲，兩組患者在年齡、性別等一般資料具有可比性，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 兩組血清miR-181a-5p 檢測 兩組均于入院24 h 內(nèi)采集空腹外周靜脈血5 mL，離心分離血清，-80 ℃低溫冰箱保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測兩組血清miR-181a-5p，應(yīng)用miRNA 提取試劑盒提取患者血清中的總RNA， 應(yīng)用TRIzol 試劑提取HCASMC 細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以U6 作為內(nèi)參基因。使用的引物序列如下：miR-181a-5p 引物序列：上游：5'-GCCGAACATTCAACGCTGTCG-3'，下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt代表miR-181a-5p的相對表達(dá)量，重復(fù)測算3次，取平均值。

1.3 miR-181a-5p 對HCASMC 細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)控作用觀察

1.3.1 HCASMC 細(xì)胞分組及miR-181a-5p 模擬物、miR-181a-5p 抑制物轉(zhuǎn)染方法 取對數(shù)生長期HCASMC 細(xì)胞分為一、二、三、四組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 分別轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics、mimics-NC、miR-181a-5p inhibitor、inhibitor-NC，培養(yǎng)24 h 時(shí)采用qRT-PCR 法檢測各組細(xì)胞miR-181a-5p。一、二、三、四組細(xì)胞miR-181a-5p相對表達(dá)量分別為6.30 ± 0.17、1.02 ± 0.04、0.46 ±0.12，與二組相比，一組細(xì)胞miR-181a-5p相對表達(dá)量高（P＜0.05），與三組相比，四組細(xì)胞miR-181a-5p相對表達(dá)量低（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染成功。

1.3.2 各組細(xì)胞增殖情況觀察 培養(yǎng)48 h 收集各組細(xì)胞，采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖情況。取各組細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞板，細(xì)胞密度為5 000/孔，每組6個(gè)平行孔，所有操作均嚴(yán)格參照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行，避光條件下各孔分別加入10 μL 的CCK-8溶液，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，在酶標(biāo)儀上測定各孔波長450 nm 處的吸光度（OD）值。以O(shè)D值代表細(xì)胞的增殖能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 各組細(xì)胞遷移情況觀察 培養(yǎng)48 h 收集各組細(xì)胞，采用Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移情況。取各組細(xì)胞，取Transwell小室置于無菌24孔板中，在Transwell 小室的上室加入0.1 mL 細(xì)胞懸液（含1×103個(gè)細(xì)胞），下室加入0.6 mL 含10 % 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，孵育24 h 后取出，棉簽擦去基質(zhì)和上室未遷移的細(xì)胞，多聚甲醛固定后染色，倒置顯微鏡下拍照，測管各組穿膜細(xì)胞數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞的遷移能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 各組細(xì)胞ADAMTS1 蛋白檢測 培養(yǎng)24 h時(shí)取各組細(xì)胞，采用Western Blotting 法檢測細(xì)胞ADAMTS1 蛋白。應(yīng)用RIPA 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA 法蛋白定量。取40 μg蛋白上樣進(jìn)行10% SDSPAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h，而后加入一抗ADAMTS1（工作濃度1∶2 000）抗體和GAPDH（工作濃度1∶5 000）抗體，4 ℃反應(yīng)過夜，次日再加入二抗（工作濃度1∶10 000），室溫孵育2 h，發(fā)光劑曝光、顯影。GAPDH 蛋白作為內(nèi)參，以蛋白條帶灰度值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測算3次，取平均值。

1.4 HCASMC 細(xì)胞中miR-181a-5p、ADAMTS1 的靶向關(guān)系觀察 取對數(shù)生長期HCASMC 細(xì)胞接種于24 孔板，分為A、B、C、D 四組，每組6 個(gè)復(fù)孔，A 組應(yīng)用LipofectamineTM2000 先后轉(zhuǎn)染ADAMTS1-MUT、miR-181a-5p mimics ；B 組 先 后 轉(zhuǎn) 染ADAMTS1-MUT、mimics-NC；C 組 先 后 轉(zhuǎn) 染ADAMTS1-WT、miR-181a-5p mimics； D 組先后轉(zhuǎn)染ADAMTS1-WT、mimics-NC，培養(yǎng)24 h 時(shí)取各組細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測各組細(xì)胞的相對熒光素酶活性。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)測算3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)性分析采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清miR-181a-5p 相對表達(dá)量比較 ACS組、對照組患者血清miR-181a-5p相對表達(dá)量分別為0.48 ± 0.04、1.01 ± 0.03，二者相比，P＜0.05。UAP患者、AMI患者血清miR-181a-5p相對表達(dá)量分別為0.76 ± 0.05、0.25 ± 0.03，二者相比，P＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力、遷移能力及ADAMTS1 蛋白相對表達(dá)量比較 培養(yǎng)48 h 時(shí)一、二、三、四組細(xì)胞 增 殖 能 力 分 別 為1.45 ± 0.12、2.15 ± 0.13、2.95 ± 0.20、2.10 ± 0.11，遷移能力分別為（18 ±5）、（45 ± 9）、（59 ± 8）、（38 ± 6）個(gè)。與二組相比，培養(yǎng)48 h時(shí)一組細(xì)胞增殖能力和遷移能力降低（P均＜0.01）；與四組相比，培養(yǎng)48 h 時(shí)三組細(xì)胞增殖能力和遷移能力高（P均＜0.01）。培養(yǎng)24 h時(shí)一、二、三、四組細(xì)胞ADAMTS1 蛋白相對表達(dá)量分別為0.19 ±0.08、0.62 ± 0.13、0.92 ± 0.14、0.52 ± 0.12，與二組相比，一組細(xì)胞ADAMTS1 蛋白相對表達(dá)量低（P均＜0.01）；與四組相比，三組細(xì)胞ADAMTS1 蛋白相對表達(dá)量高（P均＜0.01）。

2.3 各組細(xì)胞熒光素酶活性比較 A、B、C、D 組細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.03 ± 0.03、1.01 ± 0.04、0.45 ± 0.06、1.02 ± 0.05。與B 組相比，A 組細(xì)胞熒光素酶活性明顯低（P＜0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化是冠心病、腦梗死和外周血管疾病的主要原因。動脈粥樣硬化性心血管疾病仍然是全球人類死亡的主要原因，并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。冠狀動脈粥樣硬化是ACS 的病理學(xué)基礎(chǔ)，冠狀動脈粥樣硬化是一種慢性疾病，其特征是對系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素和局部促動脈粥樣硬化刺激反應(yīng)的不斷進(jìn)展。HCASMC 在動脈粥樣硬化斑塊的形成中起著至關(guān)重要的作用。內(nèi)膜內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移促進(jìn)了冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成，并且與晚期的脆弱斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)。隨著生物遺傳學(xué)的發(fā)生發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)HCASMC 異常增殖和遷移與某些基因的異常表達(dá)有關(guān)。

miRNAs 是近年來新發(fā)現(xiàn)的小的非編碼RNA 分子，約20～25 個(gè)核苷酸，通過靶向mRNA 的降解或阻斷蛋白質(zhì)翻譯作為蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，參與機(jī)體細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等功能的調(diào)控。近年來研究[10-11］顯示， miRNAs廣泛參與動脈粥樣硬化相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。李韶南等[12］發(fā)現(xiàn)血清中miR-21 水平與冠狀動脈內(nèi)斑塊的不穩(wěn)定狀態(tài)密切相關(guān)。LAI 等[13］在研究中發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清及冠狀動脈平滑肌細(xì)胞中異常增高的miR-574 促進(jìn)了冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的增長。近年來miR-135b、miR-499a 及miR-181b 等 多 個(gè)miRNA 被相繼證實(shí)參與了冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生進(jìn)展，并且與其對動脈平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移的調(diào)控有關(guān)[14-15］。miR-181a-5p 屬于miR-181 家族重要成員，廣泛參與造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、干細(xì)胞分化等調(diào)節(jié)，在腫瘤、炎癥反應(yīng)等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[6，16］。已有研究[17］顯示冠心病和肥胖代謝綜合癥患者外周血中miR-181a-5p 表達(dá)顯著降低，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACS 組患者血清中miR-181a-5p 相對表達(dá)量較對照組明顯降低，并且AMI 組患者血清中miR-181a-5p 相對表達(dá)量明顯低于UAP 患者，提示miR-181a-5p 在ACS 發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用，并且可能與粥樣斑塊穩(wěn)定性有關(guān)。

血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化發(fā)生進(jìn)展中的重要環(huán)節(jié)[18］。如何有效阻斷血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移是目前動脈粥樣硬化的研究熱點(diǎn)問題。血管平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移能夠受到miRNAs的調(diào)控。CHEN等[19］發(fā)現(xiàn)miR-155-5p在ACS 患者血清中表達(dá)下降，miR-155-5p 能夠抗動脈粥樣硬化，其機(jī)制與其對血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用有關(guān)。相關(guān)研究[20］顯示，miR-599 也能夠參與對血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力的抑制，起到阻止動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。動物實(shí)驗(yàn)顯示miR-181a-5p 與動脈粥樣硬化斑塊形成和穩(wěn)定性密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不明確[7］。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功轉(zhuǎn)染miR-181a-5p 模擬物、miR-181a-5p 抑制物至HCASMC 細(xì)胞，成功上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中miR-181a-5p 表達(dá)水平。進(jìn)一步通過采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)、Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-181a-5p表達(dá)水平，能夠明顯抑制冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力，而下調(diào)miR-181a-5p 表達(dá)水平能夠明顯促進(jìn)冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力，證實(shí)miR-181a-5p 表達(dá)與冠狀動脈斑塊的形成和穩(wěn)定性有關(guān)，上調(diào)miR-181a-5p 表達(dá)能夠起到抗動脈粥樣硬化、穩(wěn)定斑塊的作用，可能成為ACS治療的靶基因。

對下游靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是miRNA 調(diào)控細(xì)胞功能的重要機(jī)制。miRNA 能夠通過對下游一個(gè)或者多個(gè)靶基因的調(diào)控，通過不同的分子通路參與機(jī)體細(xì)胞功能的調(diào)控。既往研究顯示ADAMTS1 基因可能是miR-181a-5p 的下游作用靶基因[9］。ADAMTS1是一種分泌性蛋白酶，屬于ADAMTS 家族成員，能夠通過參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重組，并且能夠激活不同的細(xì)胞表面分子，在腫瘤、炎癥和血管形成中起著發(fā)揮著重要的作用[21］。近年來越來越多的研究表明ADAMTS1與動脈粥樣硬化關(guān)系密切，與斑塊的形成及不穩(wěn)定性密切相關(guān)[8］。研究[22］發(fā)現(xiàn)ACS 患者血清中ADAMTS1的表達(dá)水平顯著升高，并且AMI患者隨著心肌梗死面積的增加，患者血漿中ADAMTS1水平越高，并且發(fā)生心血管事件比例越高[23］。研究[24］已證實(shí)，動脈粥樣硬化斑塊中ADAMTS1 的表達(dá)明顯增高，抑制血管平滑肌細(xì)胞中ADAMTS1 的表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖及遷移能力[25］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p 能夠結(jié)合ADAMTS1 基因的3'UTR 從而使相對熒光素酶活性降低，上調(diào)miR-181a-5p 表達(dá)的HCASMC 細(xì)胞ADAMTS1 蛋白表達(dá)下降，而下調(diào)miR-181a-5p表達(dá)的HCASMC細(xì)胞ADAMTS1 蛋白表達(dá)升高，說明ADAMTS1 是miR-181a-5p的直接作用靶基因。

綜述所述，ACS患者血清中miR-181a-5p在表達(dá)低，miR-181a-5p可抑制HCASMC細(xì)胞的增殖和遷移。miR-181a-5p 可通過靶向抑制HCASMC 細(xì)胞ADAMTS1蛋白表達(dá)，抑制HCASMC細(xì)胞的增殖和遷移。