抑制hsa_circRNA6448-14表達對人食管鱗狀細胞癌細胞系KYSE30及KYSE150侵襲遷移的影響

王平，李夢輝，張耀文

1 河南科技大學臨床醫(yī)學院放療科，河南洛陽 471003；2 河南科技大學第一附屬醫(yī)院；3 安陽市腫瘤醫(yī)院河南科技大學附屬安陽腫瘤醫(yī)院放療科；4 河南省食管癌精準防治醫(yī)學重點實驗室

食管癌是河南常見的惡性腫瘤之一，其中以食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）最常見[1］。ESCC 的病死率極高，發(fā)病機制至今尚未完全明確[2］。因此，尋找ESCC 早診早治的分子標志物對改善患者的預后具有重要意義。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，可通過調(diào)控天然小RNA（microRNAs，miRNAs）活性，參與結合轉錄調(diào)控元件及轉錄蛋白互作基因等過程[3］，且具有結構穩(wěn)定、種類豐富、特異性強、序列保守等特點。circRNA 具有海綿體機制，可與RNA 分子相互作用，競爭性吸附MicroRNAs（miRNAs），通過調(diào)節(jié)miRNA 的活性來影響細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程。circRNAs 既可以作為癌基因促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，又可以作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時circRNA 已被證實可作為肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤的生物標志物用于疾病的診斷和預后判斷[4-5］。最新研究[5］發(fā)現(xiàn)，ESCC 組織中的circRNA 可作為miRNA 海綿，誘導ESCC 細胞的上皮-間充質(zhì)轉化，調(diào)控靶基因表達，促進ESCC 細胞的增殖、侵襲及遷移。我們前期研究[6-7］發(fā)現(xiàn)，ESCC 組織和細胞中hsa_circRNA6448-14表達升高，且hsa_circRNA6448-14表達與ESCC分化程度、pTNM 分期呈負相關，與患者的低位生存期呈正相關。為進一步研究hsa_circRNA6448-14 與ESCC 的惡性生物學行為的關系，2022年8月—2023年10 月，我們觀察了抑制hsa_circRNA6448-14 表達對人ESCC細胞系KYSE30及KYSE150侵襲、遷移的影響，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 ESCC 細胞系KYSE30 及KYSE150（本實驗室凍存）。1640 培養(yǎng)基及胎牛血清（美國Gibco 公司）；Lipofectamine2000 轉染試劑（美國Invitrogen 公司）；hsa_circRNA6448-14-siRNA（干擾hsa_circRNA6448-14 表達）及siNC（上海吉瑪基因公司）；hsa_circRNA6448-14 上游引物為5'-CCAATGGGGACTGTCATGGA-3'，下 游 引 物 為5'-TCATGCCGTGTTTCAGCTCA-3'，GAPDH 上游引物為5'-GTGGAGTCCACTGGCGTCT-3'，下游引物為5'-GTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3'（中 國Sangon Biotech 公司）；TRIzol 試劑盒（美國Thermo 公司）；反轉錄試劑盒及qPCR 試劑盒（中國Vazyme 公司）；PBS緩沖液、4%細胞固定液及1%結晶紫染液（中國Solarbio 公司）；Matrigel 膠（美國Sigma-Aldrich 公司）。熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）；成像系統(tǒng)（美國Thermo 公司）；倒置光學顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 抑制hsa_circRNA6448-14 表達的KYSE30、KYSE150 細胞構建 常規(guī)培養(yǎng)KYSE30 及KYSE150細胞，將細胞各分為2組：對照組（siNC 空白質(zhì)粒組）及敲降組（siRNA 干擾質(zhì)粒組），分組如下：KYSE30對照組、KYSE150 對照組、KYSE30 敲降組和KYSE150 敲降組。待各組細胞密度為70%時，根據(jù)說明書分別將siNC 及hsa_circRNA6448-14-siRNA與Lipofectamine2000 轉染試劑混合，對照組細胞轉染siNC 轉染混懸液進行，敲降組細胞轉染hsa_circRNA6448-14-siRNA 轉染混懸液進行。轉染48 h時采用qRT-PCR 檢測各組細胞hsa_circRNA6448-14，具體步驟參考說明書及文獻[7］。KYSE30 敲降組、KYSE30 對照組、KYSE150 敲降組及KYSE150 對照組hsa_circRNA6448-14 相對表達量分別為0.23 ±0.01、1.00 ± 0.05、0.25 ± 0.01、1.02 ± 0.03，與對照組比較，敲降組細胞hsa_circRNA6448-14 的相對表達量低（P均＜0.05），表明成功培養(yǎng)出抑制hsa_circRNA6448-14 表 達 的KYSE30、KYSE150 細胞，可用于后續(xù)實驗。

1.3 各組細胞侵襲情況觀察 采用Transwell 實驗。取“1.2”中各組細胞，于無胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h。采用Matrigel膠（50 mg/L）包被Transwell 小室基底膜，并于Transwell 下室加入含10%胎牛血清的1640。取各組饑餓培養(yǎng)后的細胞100 μL（含1 × 105個細胞），分別加入Transwell 小室。培養(yǎng)24 h 后，取出Transwell 小室，并擦去內(nèi)層細胞。將小室外層細胞于PBS緩沖液清洗、4%細胞固定液固定、1%結晶紫染液染色后，對外層細胞進行拍照并計數(shù)[8］。均選10個視野，采用Image J 軟件測算各組穿膜細胞數(shù)（代表侵襲能力），實驗重復3次，取平均值。

1.4 各組細胞遷移情況觀察 采用劃痕實驗。取“1.2”中各組細胞，于6 孔板中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞密度為70%后，采用無菌槍頭（200 μL）進行劃痕。PBS 緩沖液清洗后更換為新鮮培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基），常規(guī)培養(yǎng)。每隔 6 h 拍照并記錄一次細胞遷移面積。細胞遷移面積測量軟件及計算方法參照文獻[8］。應用Image J 軟件測量不同時間點劃痕內(nèi)空白面積的大小，計算遷移面積，比較兩組細胞不同時間點遷移面積的大小，實驗重復3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad 8.0 統(tǒng)計軟件。采用K-S 檢驗進行正態(tài)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組穿膜細胞數(shù)比較 培養(yǎng)24 h 時 KYSE30敲降組、KYSE30 對照組、KYSE150 敲降組及KYSE150 對照組穿膜細胞數(shù)分別為58.00 ± 3.61、161.33 ± 4.06、69.00 ± 2.08、191.33 ± 6.39。與對照組比較，培養(yǎng)24 h 時敲降組細胞穿模細胞數(shù)小（t分別為19.04、18.21，P均＜0.05）。

2.2 各組細胞遷移面積比較 培養(yǎng)24 h 時KYSE30 敲降組、KYSE30 對照組、KYSE150 敲降組及KYSE150 對照組細胞遷移面積分別為（11.67 ±0.88）、（26.00 ± 1.73）、（14.33 ± 0.88）、（28.00 ±1.53）mm2。與對照組比較，培養(yǎng)24 h 時敲降組細胞遷移面積小（t分別為7.37、7.75，P均＜0.05）。

3 討論

中國占食管癌全球病例的50%以上，ESCC 是主要的組織學類型。ESCC 的高危因素有吸煙、飲酒、飲食習慣、遺傳易感性、免疫功能紊亂等，目前，ESCC 的主要治療策略包括手術切除、放療、化療和靶向療法。其中，手術切除是早期ESCC 的首選治療方法。然而，由于多數(shù)ESCC 在診斷時已經(jīng)進展到晚期，因此，手術切除的效果受限。ESCC 的發(fā)生是一個多步驟、多階段的過程，涉及到基因突變、表觀遺傳改變、微環(huán)境改變和免疫逃逸等多個層面，但具體病因尚未明確。隨著對ESCC 分子機制的深入了解，一些新的靶向療法也正在開發(fā)中，如針對EGFR、VEGF 和PD-L1 的抗體藥物[9］。但由于ESCC起病隱匿，5 年生存率仍極低，因此，繼續(xù)尋找ESCC的診斷標記物和治療靶點至關重要。

circRNA 是一組內(nèi)源性非編碼RNA，具有穩(wěn)定的共價閉環(huán)結構，與線性RNA 相比，這一特性使得它們對RNA 核酸外切酶具有抗性。它們在細胞中的表達具有組織特異性、發(fā)育階段依賴性和疾病相關性，circRNA 可以通過調(diào)控基因表達來影響腫瘤的發(fā)展。circRNA 可以作為miRNA 的“海綿”，與miRNA 結合形成circRNA-miRNA 復合物，從而釋放出miRNA 的靶基因，影響靶基因的表達水平。這種調(diào)控機制可以影響腫瘤相關基因的表達以及細胞的增殖、轉移和侵襲能力，從而影響腫瘤的發(fā)展[15］。甲狀腺癌中，has_circRNA0058124可通過miR-218-5p/NUMB 調(diào)控NOTCH3/GATAD2A 軸促進癌細胞侵襲及轉移，且顯著縮短患者生存期[16］；前列腺癌中，circCSNK1G3 可通過調(diào)控miR-181 促進癌細胞惡性增殖，降低其治療敏感性[17］；肝癌中，circASAP1 可通過調(diào)控miR-326/miR-532-5P-MAPK1 信號通路促進癌細胞遠處轉移，引起患者耐藥及復發(fā)[18］；非小細胞肺癌中，circFGFR1 可通過miR-381-3P 誘導CXCR4高表達，引起癌細胞抵抗凋亡，導致其免疫逃逸[19］；胃癌中，hsa_circ_0001725可通過miR-150-5P/c-Myc 軸參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，hsa_circ_001852通過海綿樣吸附miR-139-5p 增加CCT5 基因表達促 進 胃癌惡性進展[20］，hsa circ 0014606 亦可通過miRNA-194- 5p 上調(diào)YAP1 基因的表達，發(fā)揮促進腫瘤增殖、遷移以及侵襲功能。骨肉瘤中，circMYO10可通過miR-370-3P/RUVBL1 軸引起染色質(zhì)重塑，增強β-catenin/LEF1 轉錄活性，促進癌細胞上皮間質(zhì)轉化，導致其惡性轉移[21］。肝內(nèi)膽管細胞癌中，hsa_ circ_002174 充當海綿來調(diào)節(jié)miR-149 的表達，進而調(diào)節(jié)Oct-2/IL-16信號通路促進肝內(nèi)膽管細胞癌的惡性進展[22］。腎細胞癌中，Circ 0008717作為ceRNA海綿作用于miR-217，減少其對FBX017 表達的抑制作用，從而促進腎細胞癌的進展[23］。綜上，circRNA的表達水平可以作為人類各種腫瘤的診斷和預后指標，為腫瘤的治療提供重要依據(jù)。

circRNA 在ESCC 發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。其中充當miRNA-7（miR-7）海綿的環(huán)狀RNA-7（ciRS-7），也稱CDR1as，在食管癌中研究中最為多見。既往報道稱miRNA-7 具有腫瘤抑制因子作用，可通過多種作用機制抑制不同腫瘤類型的進展，包括遷移、侵襲以及上皮間質(zhì)轉化等[19］。ciRS-7含有超過70 個miR-7 的結合位點，能夠有效地吸附miR-7，抑制miR-7 功能并上調(diào)相關基因的表達，如RS2 和EGFR[20］，解除miR-7 對其靶基因的抑制作用，從而促進腫瘤的發(fā)展。在ESCC 中，ciRS-7 不僅可通過miR-7 激活NFκB/p65 通路促進ESCC 細胞生長，還可通過miR-7 激活KLF4 促進ESCC 細胞遷移[21-22］。circ_0000654 可通過miR-149-5P 激活IL-6/STAT3通路誘發(fā)炎癥反應，降低ESCC 細胞的放療敏感性[23］。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA6448-14高表達的ESCC 患者生存期縮短[6-7］，包括總生存期（OS）與無進展生存期（PFS），提示預后不良，表明hsa_circRNA6448-14 參與了ESCC 的發(fā)生發(fā)展。為了進一步探討hsa_circRNA6448-14 表達情況對ESCC 細胞生物學行為的影響，本研究建立hsa_circRNA6448-14 敲 降 的ESCC 細 胞 系（KYSE30 及KYSE150 細胞系），采用Transwell 細胞侵襲實驗及劃痕實驗檢測親本與敲降細胞系的體外侵襲及遷移能力。結果表明，與親本細胞系相比，hsa_circRNA6448-14 敲降的ESCC 細胞系的體外侵襲及遷移能力均顯著減弱，提示靶向hsa_circRNA6448-14可有效抑制ESCC 細胞的惡性侵襲及遠處遷移，表明hsa_circRNA6448-14 為ESCC 細胞侵襲及遷移過程中的關鍵調(diào)控因子。以往的研究表明，circRNA的功能主要是作為海綿吸附miRNA，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達。因此，筆者推測hsa circRNA6448-14 也可能作為海綿調(diào)節(jié)miRNA，參與ESCC 的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)實驗計劃通過研究circRNA/miRNA 軸，初步探索hsa circRNA6448-14在ESCC中的作用機制。

綜上所述，抑制hsa_circRNA6448-14 表達后KYSE30 及KYSE150 細胞的侵襲遷移能力均降低，hsa_circRNA6448-14 可能在ESCC 細胞的侵襲及遷移過程中發(fā)揮重要作用，靶向hsa_circRNA6448-14可能是ESCC治療的新方法。