甘薯抗莖腐病鑒定技術的建立及種質資源抗性分析

柴榮耀,游雨欣,,邱海萍,郭峻寧,張 震,李 斌,沈升法,王艷麗,*

(1.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所/省部共建農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室/浙江省國家農作物品種抗性鑒定試驗站,浙江 杭州 310021; 2.浙江大學 生物技術研究所,水稻生物育種全國重點實驗室/農業農村部作物病蟲分子生物學重點實驗室/浙江省作物病蟲生物學重點實驗室,浙江 杭州 310058; 3.浙江省農業科學院 作物與核技術利用研究所,浙江 杭州 310021)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是我國第四大糧食作物[1],具有營養價值高、生長適應性廣、生產期長等特點。然而,由達旦提狄克氏菌Dickeyadadantii侵染引起的甘薯莖腐病是嚴重為害甘薯的一種細菌性病害[2],在浙江、河北、河南等省份發生較為嚴重[3],現已被列入浙江省植物檢疫性有害生物補充檢疫對象名錄[4]。該病原菌寄主范圍廣,致病力強,主要為害薯苗、莖蔓、葉片和薯塊等部位,對甘薯生產造成毀滅性的影響,至今仍缺乏系統有效的防治措施[5]。因此,尋找具有抗莖腐病的甘薯新品種十分必要。

選育和種植甘薯莖腐病抗病品種是針對甘薯莖腐病最為經濟有效環保的防治方法,也是控制病害的最根本措施之一。在抗病品種的選育過程中,需要進行大量的抗病性鑒定試驗,因此,建立完善的病害抗性鑒定評價方法是重要前提。操作簡單、快速準確的接種鑒定方法是研究中不可或缺的。目前,植物病原細菌的接種方法較多[6-7][8],如剪葉法、浸(蘸)根法、針刺法、噴霧法、摩擦法、注射法和灌注土壤法等。這些方法因細菌病害和寄主不同,作用效果也不同。在甘薯莖腐病的研究中,以往用的針刺法[9]和薯塊切片接菌法[10]以及已報道的剪葉法、噴霧法等常用的細菌病害接種方法[11],都存在一些弊端,如得到的致病甘薯的發病癥狀不穩定,接菌量很難保證一致,不適用于甘薯莖腐病的大規模接種抗性鑒定[12]等。因此,建立一種操作簡單、快速準確、效果穩定的抗性鑒定方法對于甘薯的種質資源和育種材料的篩選以及品種抗性評價至關重要。

本文旨在建立和優化甘薯莖腐病的抗性鑒定技術,選取最佳接種方式和接種菌液濃度建立甘薯抗莖腐病鑒定標準,通過對6個代表性種質進行室內接種與田間抗性比對驗證,用于室內接種抗性精準鑒定;對65份甘薯種質進行室內接種抗性鑒定,明確這些種質的真實抗性水平,并選育和種植對甘薯莖腐病表現出穩定抗性的品種來防治該病害,為種植抗莖腐病、綜合性狀好的甘薯和生產提供技術支持,為甘薯抗莖腐病育種和品種的抗性改良提供可利用的抗性資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘薯種質資源共65份,均由浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所薯類育種與栽培研究室提供。

供試菌株為達旦提狄克氏菌 (Dickeyadadantii) dd1、dd2,由浙江省農業科學院植物保護和微生物所分離、鑒定和保存。

接種菌液制備:活化保存的甘薯莖腐病菌,挑取單菌落在NA培養基上劃線,置于28 ℃培養箱中培養48 h。挑取單菌落于LB液體培養基中,在搖床中以28 ℃,200 r·min-1培養24～36 h。用無菌水配成濃度為4.4×108CFU·mL-1的菌懸液作為接種菌液。

1.2 甘薯莖腐病接種方法

根據田間甘薯莖腐病發病特點和品種抗性鑒定研究工作所需要求,設計了薯苗不同扦插栽培方式、病菌不同接種方式等多種病害接種方法進行接種鑒定技術研究。

1.2.1 盆栽土壤扦插接菌法

在張鴻等[13]的基礎上進行改進。用口徑20 cm的育苗盆裝適量無菌潮濕沙壤土,用無菌手術刀將甘薯苗主莖或側枝修剪成帶有3～4片展葉的莖枝進行扦插移栽,并在薯苗基部澆灌2 mL接種菌液,以等量無菌水作為對照。接種后逐天觀察甘薯苗發病情況,并對各處理組進行發病結果調查統計。每個盆栽接種3株甘薯苗,3盆為一組,設3次重復。

1.2.2 水泥槽蛭石拌菌移栽法

在水泥槽中鋪滿無菌略潮濕的蛭石,將接種菌液拌入蛭石中,使其濕潤。接著扦插新生的3～4片真葉的甘薯苗,每區栽插10株甘薯苗為一組,共設3組重復。以無菌水蛭石作為對照組。接種后逐天觀察甘薯苗發病情況,并對甘薯苗進行病害等級鑒定。

1.2.3 試管菌液插苗法

在張希太等[14]的基礎上進行改進。甘薯苗直接插入裝有5 mL接種菌液的試管中培養,置于可控溫控光的培養室內,溫度為30 ℃,空氣相對濕度為80%。以裝有無菌水的大試管為對照。10株甘薯苗為一組,設3次重復。逐天觀察并統計甘薯苗在試管中的發病情況。

1.2.4 組培瓶蛭石菌液浸苗扦插法

參照劉偉明等[15]的接種方法,并在此基礎上加以改進。將帶有3～4片展葉的薯苗基部輕輕置于菌懸液(菌液濃度為4.4×108CFU·mL-1)中浸泡2 min。在組培瓶中裝滿無菌水,使蛭石充分濕潤,將處理過的薯苗扦插于蛭石中,置于可控溫控光培養室內培養,溫度為30 ℃,空氣相對濕度為80%;以浸泡無菌水的薯苗為對照。每個組培瓶中培養1株,9株為一組,每組重復3次。在接種后逐日記錄甘薯苗的發病情況。

1.2.5 組培瓶蛭石扦插灌根法

在謝越盛等[16]的基礎上,加以改進。在組培瓶中裝滿無菌水,使蛭石充分濕潤,扦插帶有3～4片展葉的薯苗于蛭石中,在薯苗基部澆灌1 mL的接種菌液。以澆灌無菌水為對照。置于溫度為30 ℃,濕度為80%的可控溫控光培養室內,逐天調查發病情況。每個組培瓶中培養1株,9株為一組,每組重復3次。

1.2.6 組培瓶蛭石薯苗針刺法

在柴一秋等[17]方法的基礎上進行改進。在裝有無菌水的組培瓶中填充蛭石并充分濕潤。選取帶有3～4片展葉的健康薯苗,將其莖基部用無菌針頭刺傷,取1 mL配制好的接種菌液滴加在針刺傷口處(傷口全部在空氣中),以滴加無菌水為對照。之后用滅菌濕棉球包扎傷口,放入裝滿蛭石的組培瓶中,置于培養室內培養(溫度為30 ℃,濕度為80%)。每個組培瓶中培養1株,9株為一組,每組重復3次。

1.2.7 組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法

在無菌條件下,將帶有3～4片展葉的薯苗用600目砂紙在距下端剪口5 cm莖基處輕擦出0.5～1 cm的傷口,并扦插到蛭石中,使得傷口處一部分沒入蛭石,另一部分暴露在空氣中,用移液槍滴加1 mL接種菌液于甘薯苗擦傷處,置于可控溫控光培養室內培養(溫度為30 ℃,濕度為80%)。以滴加無菌水為對照。每個組培瓶中培養1株,9株為一組,每組重復3次。

1.3 甘薯莖腐病菌接種菌液濃度

在作物細菌病害接種中,病菌接種菌液濃度會影響作物發病情況,因此,在作物抗病性鑒定中需明確最佳接種菌液濃度。本文上述不同接種方法的對比試驗中,所采用的甘薯莖腐病菌接種菌液濃度均為4.4×108CFU·mL-1(D600=0.2)。前人研究表明,在選取了已明確田間抗病性表現為抗病、中感、感病的3個甘薯品種,用濃度為4.4×108CFU·mL-1的菌懸液進行擦傷接種,結果發現甘薯發病程度偏重,可能是由于接種菌液濃度過高引起的[18]。為此,本文通過對接種菌液進行不同濃度的稀釋,以確定甘薯莖腐病抗性鑒定的最佳接種菌液濃度。

以中感甘薯品種浙薯33為研究材料,采用上述試驗中最佳的接種方法進行培養,以濃度為4.4×108CFU·mL-1的菌懸液(D600=0.2)作為母液,通過稀釋不同濃度(稀釋1倍、10倍、40倍、100倍和1 000倍)進行接種,即接種菌液濃度梯度為2.2×108、4.4×107、1.1×107、4.4×106和4.4×105CFU·mL-1。以無菌水為對照,每種濃度重復3次。

1.4 新抗莖腐病鑒定技術的驗證與應用

選取甘薯品種和不同的接種方法,確定最佳的接種方式和接種菌液濃度,建立鑒定標準。選擇最具代表性的6個代表性甘薯品種材料,采用最佳的接種方式和接種菌液濃度進行室內鑒定,與田間抗性品種比較的驗證,以確定該抗莖腐病鑒定技術的準確性。并對65個甘薯材料進行抗病鑒定,在接種后一段時間內觀察甘薯的發病情況,根據鑒定標準對甘薯品種的抗病性進行評估,并給出相應的分級標準。

通過多次重復測定試驗,根據甘薯整體品種材料的發病癥狀特點與抗性表現,結合田間病圃實際結果以及相關參考文獻資料,參照文獻的病害分級標準[19],加以改進:根據病情類型分為0級(高抗)、1級(抗病)、3級(中抗)、5級(中感)、7級(感病)以及9級(高感)這六種類型,其中各病級對應癥狀的表型見表1。

表1 甘薯莖腐病薯苗接種病情分級標準Table 1 Grading criteria for inoculation of sweet potato stem rot seedlings

以作物病情指數(DI)來評價作物抗病性是常用的科學評價方法[20],參照此標準,對甘薯莖腐病病情指數進行計算。甘薯莖腐病病情指數(DI)的計算公式如下:

式中:VDI,病情指數的值;Pi,各級發病株數;Di,各級代表值;P,調查總株數;Dm,最高級代表值。根據參與鑒定全部甘薯品種材料的發病與抗性表現,結合田間病圃實際結果,參照文獻的評價標準[21],確定甘薯莖腐病抗病性按病情指數(DI)來評價的抗性評價分類為抗病(R)、中抗(MR)、中感(MS)、感病(S)。抗性評價標準病情指數區間見表2。

表2 甘薯莖腐病抗病性評價標準Table 2 Evaluation criteria for resistance to stem rot of sweet potato

2 結果與分析

2.1 不同接種方法對薯苗發病程度的影響

實驗結果表明,薯苗經不同接種方法接種菌液后,均能引起薯苗發生莖腐病甚至死亡,但不同接種方法間發病程度、穩定性與效果仍存在很大差異(圖1、表3)。

圖1 不同接種方法薯苗莖腐病發病死亡率Fig.1 Mortality rate of stem rot of potato seedlings by different inoculation methods

表3 甘薯莖腐病不同接種方法效果比較Table 3 Comparison of the effectiveness of different inoculation methods for sweet potato stem rot

試管菌液插苗法具有快速發病和高發病率的特點,但發病過于嚴重(圖2-A),無法區分品種的抗性;組培瓶蛭石菌液浸苗扦插法也存在類似問題。組培瓶蛭石薯苗針刺法發病嚴重且不穩定。水泥槽蛭石拌菌移栽法發病緩慢且條件不易控制。組培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法發病緩慢,時間周期長且發病率低(圖2-B)。經多次實驗表明,組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法接種最優。該方法易于控制溫度、濕度等相關條件,發病率較為一致。初始發病時,薯苗擦傷接種部分出現水漬狀斑,隨著時間的推移逐漸變成黑褐色軟腐斑,病部伴有惡臭味,隨后甘薯莖基腐爛死亡(圖2-C)。該癥狀與田間莖腐病相似。

A,試管菌液插苗法;B,盆栽土壤扦插接菌法;C,組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法。A, Tube innoculation method; B, Potting soil inoculation method; C, Scratch innoculation method of seedlings in tissue culture bottles with vermiculite.圖2 不同接種方法的薯苗發病情況Fig.2 Morbidity of potato seedlings by different inoculation methods

2.2 不同接種菌液濃度對薯苗發病程度的影響

采用組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法對不同接種菌液濃度的薯苗進行處理。研究結果表明,經母液稀釋40倍(1.1×107CFU·mL-1)菌液濃度接種后的效果最佳,接種2～3 d后薯苗開始顯癥,在擦傷接菌部出現水漬狀斑,后期形成黑褐色軟腐斑,甚至導致甘薯莖基腐爛死亡,該癥狀與田間莖腐病相似(圖3);經母液(4.4×108CFU·mL-1)、稀釋1倍(2.2×108CFU·mL-1)和10倍(4.4×107CFU·mL-1)的接種菌液處理后的薯苗,其抗性評價仍高于中感級別;經稀釋100倍(4.4×106CFU·mL-1)和1 000倍(4.4×105CFU·mL-1)的接種菌液濃度處理后,薯苗發病率低、病癥輕且顯癥極慢。基于上述結果,明確甘薯莖腐病抗性鑒定的最佳接種菌液濃度為1.1×107CFU·mL-1。

圖3 接種菌液不同濃度薯苗莖腐病發病死亡率Fig.3 Mortality rate of stem rot of potato seedlings inoculated with different concentrations of bacterial solution

2.3 新抗莖腐病接種鑒定技術的驗證

本文選取了7個具有代表性的甘薯品種(浙紫薯1號、FM11、浙薯38、浙薯33、浙薯13、浙733和浙薯26),采用組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法對其進行室內接種抗性鑒定,接種菌液濃度為最適菌液濃度1.1×107CFU·mL-1,同時在基地自然病圃進行田間抗性品比,最終調查結果顯示室內接種抗性鑒定結果與田間抗性表現基本一致(圖4)。因此,可以確立新抗莖腐病鑒定技術方法為采用組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法、接種菌液濃度為1.1×107CFU·mL-1。

圖4 甘薯品種室內抗莖腐病鑒定結果與田間抗性品比的驗證Fig.4 Validation of the results of indoor identification of sweet potato varieties for resistance to stem rot with field resistance ratios

2.4 新抗莖腐病鑒定技術的應用

通過新抗莖腐病鑒定技術,采用dd1、dd2的混合菌株對65個甘薯品種材料進行了抗莖腐病室內接種鑒定,該方法接種甘薯植株病情擴展迅速,接種后6 d感病品種發病可達9級;品種抗性區分度較好,接種6 d后品種間病情指數表現為0.9～77.4(表4)。

表4 甘薯品種資源對莖腐病抗性鑒定結果Table 4 Results of the identification of sweet potato variety resources for resistance to stem rot

根據甘薯莖腐病抗病性評價標準,鑒定品種材料中有7個品種材料病情指數(DI)≤5,表現為抗病,占鑒定材料的10.8%,分別為YD7002、DY7082-1、浙紫薯1號、TF1118、DY7032、南薯88、浙紫薯4號;有12個品種材料病情指數在550,表現為感病,占比為23.0%(圖5)。抗性鑒定結果為品種推廣與抗病育種提供了依據。

圖5 六十五個甘薯種質資源中對莖腐病各抗性水平占比Fig.5 Percentage of each level of resistance to stem rot in 65 sweet potato germplasm resources

3 結果與討論

選育和種植甘薯抗病品種是防治莖腐病的有效措施,需進行抗性鑒定。建立簡便準確的接種鑒定方法是研究不可或缺的前提。目前報道甘薯莖腐病抗性的研究較少,本文設計了不同薯苗扦插栽培方式、病菌不同接種方式對其進行接種鑒定。采用不同的人工接種方式,甘薯莖腐病的發病程度具有明顯差異。利用試管菌液插苗法和組培瓶蛭石菌液浸苗扦插法進行鑒定,發現這兩種方法導致了較嚴重的發病情況,難以區分不同甘薯品種的抗性,在實際應用中的可行性較低;組培瓶蛭石薯苗針刺法、水泥槽蛭石拌菌移栽法、組培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法,這些方法都展現出了一定程度的優勢,發病較為緩慢且穩定,條件易于控制。然而,組培瓶蛭石薯苗針刺法的發病程度嚴重且不穩定,可能由于針刺導致的傷口感染引起了過度的病原菌侵染。水泥槽蛭石拌菌移栽法表現出一定的成活率和抗性評價,但發病緩慢且條件不易控制,因此,在實際應用中可能存在一些局限性。組培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法的發病程度較緩慢,時間周期長且發病率低,這些方法適于對抗性的長期評估。而組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法通過在薯苗表面進行擦傷,使病原菌更容易侵入,從而真實地反映了田間莖腐病的發病情況。與其他方法相比,該方法處理間發病較為一致,病勢進展適宜,且條件易于控制。由此可以更準確地評估甘薯的抗性,并篩選出具有穩定抗性的種質資源。因此,該方法將成為甘薯莖腐病抗育種的重要工具。

此外,接種菌液濃度的差異也會影響甘薯抗性評價。將接種菌液濃度分別稀釋不同濃度(稀釋1倍、10倍、40倍、100倍和1 000倍)進行接種,以確定甘薯莖腐病抗性鑒定的最佳接種菌液濃度。經高濃度處理后的薯苗,其抗性評價高于中感級別,低濃度處理的薯苗發病較輕,顯癥慢;而用稀釋40倍(1.1×107CFU·mL-1)時的接種菌液進行組培瓶蛭石薯苗擦傷接種效果明顯,能夠真實反映甘薯幼苗抗性。由此可見,濃度為1.1×107CFU·mL-1的接種菌液可作為最佳濃度,以進行甘薯接種鑒定。

利用組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法與最佳接菌濃度(1.1×107CFU·mL-1),建立了一種新的抗性鑒定技術。通過選取6份最具代表性的甘薯種質材料進行室內接種抗性鑒定,其發病情況與田間抗性相一致。進一步對65份甘薯種質材料進行抗莖腐病鑒定,發現絕大部分材料表現為感病或中感,其中有7份甘薯種質表現為抗性,這些具有穩定抗性的種質將成為甘薯莖腐病抗育種的重要資源,可以進一步利用這些種質進行遺傳育種和分子標記輔助選擇[22],開展甘薯抗莖腐病育種工作。雖然采用此方法進行篩選抗性品種的效果佳,顯癥明顯,但由于田間接種易受病原菌傳播、年度氣候、地理環境、管理措施等多種因素的影響,鑒定結果往往與室內存在差異[23],仍需要進一步在田間進行抗性鑒定,以明確此接種方法的有效性。

綜上所述,甘薯抗莖腐病鑒定技術的建立及種質資源抗性分析是甘薯育種中的重要研究內容,對于提高甘薯生產效益和促進其產業健康發展具有重要的意義。未來應進一步深入研究甘薯抗莖腐病的分子機理和遺傳規律,加速抗病種質資源的篩選和開發,為甘薯育種和產業發展提供更加精準的技術支持。