施用側孢短芽孢桿菌對烤后煙葉鉀含量及煙株生理特征的影響

宋 鵬,李理想,江厚龍,王 茹,李 慧,趙鵬宇,張 均,*,秦平偉,任江波,陳慶明

(1.河南科技大學 農學院,河南 洛陽 471023; 2.重慶煙草科學研究所,重慶 400715; 3.重慶市煙草公司 彭水縣分公司,重慶 409600)

煙草是嗜鉀類作物,充足的鉀素供應可增強卷煙的色澤、燃燒性和持火力[1];因此,煙葉中的鉀含量也常被用作衡量煙葉品質的重要指標之一[2]。炭疽病、氣候斑病等病害直接影響煙葉的品質與經濟效益。有研究表明,鉀元素與煙株的抗逆能力關系密切[3],增施鉀肥可通過提高作物的抗病性[4-5]進而提高煙葉的品質和經濟效益[6-7]。

目前,提高煙葉鉀含量的途徑主要包括應用鉀高效品種、增加鉀肥施用量、優化肥料配方和鉀肥施用方法與時間等[8-10]。然而,施入土壤的鉀肥大部分易被土壤固定或隨水淋失,既導致鉀肥利用率下降,又造成鉀肥資源的浪費[11-12]。近年來,人們嘗試用生物菌劑的方法來提高作物鉀含量。側孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)是一種好氧的產孢細菌[13],具有可抑制多種病蟲害、培養周期短、生產方便等特點,是常見的生防菌之一[14-15]。研究表明,芽孢桿菌具有解鉀[16]、促生[17]、降解污染物[18]等多種功能,施用芽孢桿菌可改善作物根區土壤的微生物群落結構[19]。然而,關于施用側孢短芽孢桿菌對煙株鉀含量、抗病性的影響及其生理機制的研究還鮮見報道。為此,本研究以煙草品種K326為試驗材料,在煙草移栽期施用側孢短芽孢桿菌,研究不同施用方式對烤后煙葉鉀含量及葉片抗病性、光合色素含量、抗逆生理指標的影響,探究側孢短芽孢桿菌的最佳施用方式,旨在為煙草種植過程中微生物制劑的應用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在重慶市彭水苗族土家族自治縣龍塘鄉雙星村(29°08′73″N,108°00′65″E)煙田進行。試驗地肥力中等,條件良好,土壤pH值為5.58,有機質、全氮含量分別為21.0、0.97 g·kg-1,堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為85.7、8.39、145.7 mg·kg-1。當地屬亞熱帶季風氣候,多年平均氣溫14.5 ℃,年平均降水量1 200 mm。

1.2 試驗材料與儀器

供試煙草品種為K326,由重慶市煙草公司彭水縣分公司提供。供試微生物菌株為側孢短芽孢桿菌HA-2(CGMCC編號24130),經發酵、離心濃縮、噴霧干燥制備菌粉,有效活菌數約為8×1010CFU·g-1,由河南科技大學農學院特色生物資源開發與利用實驗室提供。

UV-2600i紫外可見分光光度計,日本Shimadzu;Gr36石墨消解儀,上海晟聲自動化分析儀器有限公司;FP640火焰光度計,上海精密儀器儀表有限公司;Forma 88700V超低溫冰箱,美國Thermo Fisher;5810R高速冷凍離心機,德國Eppendorf;MGC-450光照培養箱,鄭州生元儀器有限公司。

1.3 試驗設計

采用單因素試驗設計,設置4個處理,每個處理重復3次,共計12個小區,每個小區4行,株距50 cm,行距1.2 m,四周設置保護行。2021年4月27日在煙草移栽期按照各處理的設計開展試驗:T1(對照),不施用側孢短芽孢桿菌;T2(浸根處理),將煙苗根部放入側孢短芽孢桿菌稀釋液(1 g·L-1)中浸根4 h,之后移栽覆土;T3(灌根處理),煙苗移栽后,在煙苗根部半徑5 cm范圍內均勻灌入100 mL質量濃度為1 g·L-1的側孢短芽孢桿菌稀釋液;T4(浸根+灌根),移栽前,將煙苗根部放入側孢短芽孢桿菌稀釋液(1 g·L-1)中浸根4 h,煙苗移栽后,在煙苗根部半徑5 cm范圍內均勻灌入100 mL質量濃度為1 g·L-1的側孢短芽孢桿菌稀釋液。

各處理除側孢短芽孢桿菌的施用方式不同外,其余田間栽培管理措施均按當地優質煙葉生產的標準執行。從2021年7月5日第一次煙葉達到成熟采烤水平至2021年8月26日采烤完成,共采收5次。

1.4 指標測定

分別在烤煙移栽后30 d(團棵期)、60 d(旺長期)、90 d(成熟期)在每個處理小區取代表性烤煙5株,用剪刀剪取葉片,采用丙酮法測定新鮮煙葉的葉綠素和類胡蘿卜素含量,采用氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用愈創木酚法測定過氧化物酶(POD)活性,采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛(MDA)含量。上述指標均以鮮重計。

分別在烤煙移栽后的30、60、90 d,在每個小區取5株代表性烤煙的根系,105 ℃殺青,68 ℃烘至質量恒定,備用。于采收結束時,取烤后上部煙葉(B2F)、中部煙葉(C3F)各2.5 kg,備用。將上述樣品粉碎,過20目篩,用火焰光度計法測定鉀含量。

烤煙移栽后60 d,依據國家標準GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》,田間調查供試煙株氣候斑病、炭疽病、赤星病和葉斑病的發生情況,計算發病率與病情指數。

1.5 數據處理

采用Excel 2019軟件整理數據,采用SPSS 22.0軟件進行方差分析,對有顯著(P<0.05)差異的,采用Duncan法進行多重比較。用Origin 2018軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 施用側孢短芽孢桿菌對煙株鉀含量的影響

各處理煙株根系的鉀含量隨時間推進表現出逐漸降低的趨勢(圖1)。移栽30 d時,T4處理煙株根系鉀含量達到測定時段內的最大值(2.89%),顯著高于其他處理,較T1增加16.58%,T1、T2、T3處理間無顯著差異;移栽60 d時,T2、T3處理煙株根系鉀含量與T1、T4處理的差異均不顯著,T4處理煙株根系鉀含量較T1顯著增加18.88%;移栽90 d時,T2、T3、T4處理煙株根系鉀含量較T1分別顯著增加39.98%、38.20%和28.85%。綜上,施用側孢短芽孢桿菌可提高煙株根系的鉀含量,總的來看,以浸根+灌根的施用方式整體表現最佳,單獨浸根或灌根的施用方式對根系鉀含量的影響主要表現在中后期。

同一時間柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicate significant difference between treatments at P<0.05 on the same day. The same as below.圖1 不同處理對煙株根系鉀含量的影響Fig.1 Effect of treatments on potassium content in tobacco root

施用側孢短芽孢桿菌可提高烤后煙葉的鉀含量(圖2)。T2處理烤后上部葉、中部葉的鉀含量與T1均無顯著差異;T3處理烤后上部葉的鉀含量較T1顯著提高29.77%,中部葉的鉀含量與T1無顯著差異;T4處理烤后上部葉和中部葉的鉀含量分別較T1顯著提高29.86%、67.36%。不同施用方式下作用效果的差異可能與側孢短芽孢桿菌在根系中的定殖狀況、作用時效有關。

圖2 不同處理對烤后煙葉鉀含量的影響Fig.2 Effect of treatments on potassium content in cured tobacco leaves

總的來看,浸根+灌根的處理較單獨灌根或浸根的處理更利于提高烤后煙葉的鉀含量。

2.2 施用側孢短芽孢桿菌對烤煙抗病性的影響

移栽60 d,施用側孢短芽孢桿菌處理的煙株氣候斑病、炭疽病、赤星病和葉斑病的發病率均較T1處理顯著下降(表1)。在這幾種病害中,氣候斑病的發病率最高,葉斑病的發病率最低。與T1處理相比:T2、T3、T4處理氣候斑病的發病率分別下降2.60、3.01、4.32百分點,T4處理氣候斑病的病情指數顯著降低;T2、T3、T4處理炭疽病的發病率分別下降0.76、1.17、2.11百分點,T4處理炭疽病的病情指數顯著降低;T2、T3、T4處理赤星病的發病率分別下降1.43、1.82、4.08百分點,T2、T3、T4處理赤星病的病情指數顯著降低,且T4處理赤星病的病情指數還顯著低于T2和T3處理;T2、T3、T4處理葉斑病的發病率分別下降2.87、2.53、3.24百分點,T2、T3、T4處理葉斑病的病情指數顯著降低。總的來看,T4處理下煙株對上述各種病害的抗病性最好。

表1 不同處理對煙株抗病性的影響Table 1 Effects of treatments on disease resistance of tobacco

2.3 施用側孢短芽孢桿菌對煙葉光合色素的影響

移栽30～90 d時,各處理煙葉的葉綠素含量呈現出先升高后降低的趨勢(圖3),在移栽60 d時達到測定時段內各處理下的最大值。移栽30 d時,T4處理煙葉的葉綠素含量較T1處理顯著提高16.39%,T2、T3處理煙葉的葉綠素含量與T1、T4處理均無顯著差異;移栽60 d時,T2、T3、T4處理煙葉的葉綠素含量較T1顯著提高8.48%～13.21%,且T4處理煙葉的葉綠素含量還顯著高于T2;移栽90 d時,T2、T3、T4處理煙葉的葉綠素含量同樣較T1顯著提高,其中,T4處理煙葉的葉綠素含量較T1處理顯著提高18.81%。綜上,浸根+灌根的處理可顯著提高移栽30～90 d內煙葉的葉綠素含量。

圖3 不同處理對煙葉葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of treatments on chlorophyll content in tobacco leaves

移栽30～90 d時,各處理煙葉的類胡蘿卜素含量同樣表現出先升后降的趨勢(圖4)。移栽30 d時,T2、T3、T4處理煙葉的類胡蘿卜素含量較T1顯著提高10.49%～22.84%。移栽60 d時,T4處理煙葉的類胡蘿卜素含量最高,較T1處理顯著提高21.01%;T2處理煙葉的類胡蘿卜素含量與T1無顯著差異。移栽90 d時,T2、T3、T4處理煙葉的類胡蘿卜素含量均較T1顯著提高,且以T4處理煙葉的類胡蘿卜素含量最高,較T1處理顯著提高35.41%。綜上,浸根+灌根的施用方式最利于提高煙葉的類胡蘿卜素含量。

圖4 不同處理對煙葉類胡蘿卜素含量的影響Fig.4 Effect of treatments on carotenoid content in tobacco leaves

2.4 施用側孢短芽孢桿菌對煙葉抗氧化酶活性及MDA含量的影響

移栽30 d時,T4處理煙葉的SOD活性較T1處理顯著提高9.63%(圖5),但其余處理間無顯著差異。隨著生育時期推進,煙葉的SOD活性逐漸增高,處理間的差異越大。移栽60、90 d時,T2、T3、T4處理煙葉的SOD活性均顯著高于T1,且以T4處理煙葉的SOD活性最高,分別較T1處理顯著增加14.44%、18.31%。

圖5 不同處理對煙葉超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.5 Effect of treatments on superoxide dismutase (SOD) activity in tobacco leaves

測定期內,各處理煙葉的POD活性隨時間推進呈逐漸升高的趨勢(圖6)。移栽30、60 d時,僅T4處理煙葉的POD活性顯著高于T1,增幅分別為11.62%、12.17%。移栽90 d時,T2、T3、T4處理煙葉的POD活性較T1處理顯著增加4.87%～13.81%,以T4處理煙葉的POD活性最高,且顯著高于T2處理。總的來看,測定期內T4處理煙葉的POD活性始終最高,說明該施用方式提升煙葉POD活性的效果最佳。

圖6 不同處理對煙葉過氧化物酶(POD)活性的影響Fig.6 Effect of treatments on peroxidase (POD) activity in tobacco leaves

移栽30～90 d,煙葉的MDA含量隨時間推進總體呈遞增趨勢(圖7),且各時期都以T1處理煙葉的MDA含量最高。移栽30 d時,T2處理煙葉的MDA含量與T1無顯著差異,T4處理煙葉的MDA含量較T1處理顯著降低30.99%。移栽60 d時,T2、T3、T4處理煙葉的MDA含量均顯著低于T1,且以T4處理最低,較T1處理顯著降低29.39%。移栽90 d時,T2、T3、T4處理葉片的MDA含量分別較T1顯著降低9.45%、14.47%、20.76%,且T4處理葉片的MDA含量還顯著低于T2和T3處理。總的來看,施用側孢短芽孢桿菌可降低葉片的MDA含量,單獨采用浸根或灌根方式的效果無顯著差異,浸根+灌根處理的效果最佳。

3 討論

提高煙葉鉀含量有利于提升烤煙品質[20]。為了實現煙葉增鉀提質的目標,生產上已廣泛采用增施鉀肥、優化施鉀方式、增加追肥次數[21-22]等措施,并導致鉀肥過量施用、資源浪費和用工成本增加等問題[23]。研究發現,芽孢桿菌是一種典型的根際促生菌,側孢短芽孢桿菌具有解鉀的功能,同時具有防病及促生作用。劉芳等[24]研究表明,微生物菌劑配施腐殖酸鉀可顯著增加土壤的速效鉀含量,提高作物鉀含量。芽孢桿菌與煙株根際的解鉀細菌具有親和性[25],施用側孢短芽孢桿菌可在干旱條件下促進玉米鉀累積,提高其抗旱性與產量[17]。煙株中上部葉的鉀含量偏低,多與生育后期土壤供鉀不足、根系吸收減少有關[26]。本研究發現,施用側孢短芽孢桿菌可促進根系鉀吸收,提高根系鉀含量,顯著提高烤后煙中上部葉的鉀含量,其中,以浸根+灌根方式的效果最佳,但與灌根方式相比,二者上部葉的鉀含量差異不顯著,這可能是由于雖然浸根+灌根處理增加了根系及中部葉的鉀含量,但由于生物競爭,上部葉獲得的鉀素來源少,因而效果不及中部明顯。

在當前的煙葉生產中,由于煙田土壤微生物結構破壞、土壤酶活性降低及作物抗性下降,病害頻繁發生,嚴重影響煙葉的產量、品質和種植效益[27]。側孢短芽孢桿菌可產生多種抗菌物質,對植物病原真菌及細菌均有一定的抑制作用[28],可以預防番茄青枯病的發生[29],對煙草黑脛病菌也具有抑制作用[30]。本研究發現,施用側孢短芽孢桿菌可提高煙株的鉀含量,提高其對氣候斑病、炭疽病、赤星病和葉斑病的抗性。這與董艷等[31]的研究結果相似。不同施用方式相比,以浸根+灌根的效果最佳。

作物的養分吸收利用和抗病性均與其抗逆能力有關。光合作用可間接反映作物的長勢與抗逆性[32]。葉綠素a、b分別是光反應的中心色素分子和捕光色素分子,類胡蘿卜素是內源抗氧化劑,可淬滅活性氧,防止細胞膜脂過氧化[33]。作物體內的SOD和POD可維持活性氧平衡、清除H2O2,保持細胞膜穩定性[34-35],而MDA的大量積累會對細胞膜和細胞造成傷害,引起植物生長發育受阻[36]。改善作物抗逆能力,提高SOD、POD活性,有利于降低其膜脂過氧化程度,提高作物的抗逆能力。施用微生物菌劑可改善作物的土壤環境,提高土壤微生物數量[37],進而促進作物葉綠素熒光參數的提高,增強其對有效光的利用[38-40]。蘇煜等[41]研究發現,增施枯草芽孢桿菌可顯著提升烤煙的光合作用效率,強化碳代謝。肖雨沁等[42]研究表明,施用側孢短芽孢桿菌可顯著提高煙苗的SOD、POD和過氧化氫酶(CAT)活性,降低MDA含量,促進煙苗根系發育,培育壯苗,提升煙葉品質。本研究發現,科學施用側孢短芽孢桿菌可顯著提高葉片的光合色素含量和抗氧化酶活性,降低MDA含量,從而提高煙草的抗逆能力。

綜上,本研究以不施用側孢短芽孢桿菌作為對照,研究浸根、灌根及浸根+灌根對煙草鉀含量、抗病性及葉片生理特征的影響。結果表明,以浸根+灌根的方式施用側孢短芽孢桿菌可以提高烤后煙葉的鉀含量,提高葉片光合色素含量,及SOD、POD活性,降低MDA含量,增強煙株對氣候斑病、炭疽病、赤星病和葉斑病的抗性。研究結果可為烤煙的優質生產提供新的思路和參考。