基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合多元統(tǒng)計分析不同炮制方法對砂仁揮發(fā)性成分的影響*

李佳鑫,周玲娟,張麗霞,蘇晶,任佳慧,周天浩,王金輝,李光

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150000;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所,云南景洪 666100;3.西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院重癥監(jiān)護科,云南景洪 666100;4.云南省南藥資源可持續(xù)利用研究重點實驗室,云南景洪 666100;5.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)傣醫(yī)藥學(xué)院,云南景洪 666100)

砂仁為姜科植物陽春砂(AmomumvillosumLour.)、綠殼砂(AmomumvillosumLour.var.xanthioidesT.L.Wu et Senjen)或海南砂(AmomumlongiligulareT.L.Wu)的干燥成熟果實[1]。砂仁性溫,味辛,歸脾、胃經(jīng),具有鎮(zhèn)痛消炎、刺激發(fā)汗、抗?jié)儭⒖咕⒔笛恰⒈Ｗo胃腸等藥理作用,在臨床上具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效,為我國著名的“四大南藥”之一[2-4]。砂仁活性成分主要為揮發(fā)油類,包括乙酸龍腦酯、樟腦、檸檬烯、龍腦等,其中乙酸龍腦酯是砂仁揮發(fā)油中主要抗炎活性成分[5]。砂仁始載于《藥性論》,炮制始見于金代張元素[6]的《醫(yī)學(xué)啟源》,書中有“搗細用”的記載,清代豐富了炮制輔料,包括姜汁、鹽等,如《嵩崖尊生全書》首次采用了用姜汁制的方法,“姜汁拌”[7]。目前臨床上砂仁多采用炒制、姜炙、鹽炙方法進行炮制,但不同炮制方法對砂仁藥材成分的影響還未見報道。本文基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectromentry,GC-MS)法結(jié)合多元統(tǒng)計分析探討砂仁經(jīng)炒制、姜炙及鹽炙后對砂仁揮發(fā)性成分的影響,以期豐富砂仁炮制理論,為深入研究砂仁不同炮制品藥理活性提供借鑒。

1 儀器與樣品

1.1儀器 MS-DL01電磁爐(中山市美蘇電器有限公司);DV215CD 分析天平(美國奧豪斯,感量:0.1 mg);FW80高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);SB-800D超聲波清洗機(寧波新藝超聲波設(shè)備有限公司);7890A GC氣相色譜(美國安捷倫公司);5975C質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司);Sigmal-14臺式低速離心機(中科星宇科技發(fā)展有限公司)。

1.2藥品與試劑 陽春砂樣品采自西雙版納州基諾鄉(xiāng),經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所張麗霞研究員鑒定為AmomumvillosumLour.;正己烷(分析純,含量:98.0%,批號:20200817,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1樣品處理

2.1.1砂仁原藥材處理方法 取砂仁原藥材剝?nèi)ネ鈿?種子團與外殼分別粉碎,用50 mL錐形瓶精密稱取1.0 g,加入溶劑正己烷20 mL,放入超聲儀器中超聲30 min(r=64 mm),然后放入離心機中5 000 r·min-1離心3 min,(r=64 mm),最后用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾,放入樣品瓶中備用。

2.1.2炮制砂仁處理方法 參照《中華人民共和國藥典》(2020年版)方法,稱取生姜15 g,擠壓榨汁后加純化水至60 mL得到姜汁,同時配制5%氯化鈉溶液。稱取陽春砂150 g,分別加入姜汁、5%氯化鈉溶液、蒸餾水60 mL,攪拌后保證樣品均浸潤,1 h后電磁爐200 W翻炒20 min直至砂仁表面吸干水分,分別得到姜炙、鹽炙、炒制砂仁樣品。放涼后剝?nèi)ネ鈿?種子團與外殼分別粉碎,參照“2.1.1節(jié)”方法處理后備用。

2.2GC參數(shù) Agilent 19091S-433色譜柱(30 m×250 μm,0.25 μm);升溫程序為初始溫度100 ℃,以5 ℃·min-1升溫至200 ℃,再以40 ℃·min-1升溫至280 ℃,并保持3 min,后運行溫度為280 ℃,運行時間為10 min;進樣口溫度250 ℃;載氣為高純氦氣,流速為1.0 mL·min-1;分流進樣,分流比10：1,進樣量為1 μL。

2.3質(zhì)譜參數(shù) 傳輸線溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;電離方式:EI源;電離電壓70 eV;掃描范圍m/z30.00～550.00,閾值為50,全掃描模式,溶劑延遲時間為2.00 min。

2.4數(shù)據(jù)處理方法 將GC-MS獲得的以“D”結(jié)尾的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)用ProteoWizard轉(zhuǎn)換成“.mzXML”格式,通過MSDIAL軟件進行預(yù)處理,包括數(shù)據(jù)基線過濾、峰識別、峰對齊、保留時間校正、提取峰面積、標準化。將得到的包含質(zhì)荷比m/z、保留時間和峰面積等的數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果導(dǎo)入SIMCAP13.0(Umetrics,瑞典)軟件和MetaboAnalyst 5.0平臺進行多元統(tǒng)計分析,首先采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)和層次聚類分析區(qū)分組間代謝物的總體差異,而后以變量投影重要性VIP>1.5及t檢驗的P<0.05篩選潛在的生物標志物,使用NIST 11數(shù)據(jù)庫進行差異性化合物鑒定。

2.5不同方法炮制對砂仁果皮及種子團揮發(fā)性成分的影響

2.5.1不同方法炮制砂仁果皮及種子團的總離子流圖 采用GC-MS法對不同方法炮制的砂仁果皮及種子團進行檢測,所得到的總離子流圖(TIC)見圖1。由圖可知,砂仁種子團及果皮之間成分差異顯著,不同方法炮制樣品之間成分也存在明顯差異。

Con-P.砂仁原藥材果皮;SP-P.炒制品果皮;JP-P.姜炙品果皮;YP-P.鹽炙品果皮;Con-Z.砂仁原藥材種子團;SP-Z.炒制品種子團;JP-Z.姜炙品種子團;YP-Z.鹽炙品種子團。

2.5.2不同方法炮制砂仁藥材的成分差異比較 采用MSDIAL軟件得到不同炮制方法砂仁果皮和種子團預(yù)處理數(shù)據(jù),使用MetaboAnalyst 5.0平臺進行有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析,得到OPLS-DA 得分圖,見圖2。

A-C.果皮;D-F.種子團;Con.原藥材;SP.炒制品;JP.姜炙品;YP.鹽炙品。

A-C.果皮,其中A為原藥材與炒制品比較;B.原藥材與姜炙品比較;C.原藥材與鹽炙品比較;D-F.種子團;其中D原藥材與炒制品比較;E.原藥材與姜炙品比較;F.原藥材與鹽炙品比較。

A-C.果皮,其中A為原藥材與炒制品比較;B.原藥材與姜炙品比較;C.原藥材與鹽炙品比較;D-F.種子團,其中D為原藥材與炒制品比較;E.原藥材與姜炙品比較;F.原藥材與鹽炙品比較。

A-C.果皮,其中A為原藥材與炒制品比較;B.原藥材與姜炙品比較;C.原藥材與鹽炙品比較;D-F.種子團,其中D為原藥材與炒制品間比較;E.原藥材與姜炙品比較;F.原藥材與鹽炙品比較。

由圖2可以看出,經(jīng)炮制后姜炙砂仁(JP)、炒制砂仁(SP)、鹽炙砂仁(YP)與砂仁原藥材(Con)的成分具有明顯差異,經(jīng)OPLS-DA處理后,兩兩之間能夠明顯分開。

為驗證OPLS-DA模型是否存在過度擬合情況,使用SIMCA-P軟件進行數(shù)據(jù)置換檢驗,得到的結(jié)果如圖3所示。由圖可知,各組R2值和Q2值均<1,Q2在Y軸的截距為負值,且R2和Q2實驗值比原始值低,證明模型沒有過度擬合。

2.6不同炮制方法砂仁藥材揮發(fā)性成分差異鑒別 為了鑒別不同炮制方法砂仁藥材的揮發(fā)性成分差異,以O(shè)PLS-DA模型第一主成分的VIP>1.5,P<0.05為標準。通過相關(guān)文獻比對,并結(jié)合NIST11數(shù)據(jù)進行快速的定性鑒別分析,從中篩選共鑒定出49個可能的差異成分,見圖4—5和表1。

表1 砂仁不同炮制品與砂仁原藥材的成分差異比較

3 討論

砂仁作為傳統(tǒng)溫中健脾藥,歷代醫(yī)家對砂仁的炮制方法也在不斷發(fā)展,最初砂仁除生用外,多為炒制,如《雷公炮制藥性解》中記載砂仁“炒,去衣研用”,隨后炮制輔料也不斷增加,多用鹽炙、姜汁炙、蘿卜汁炙等方法。而砂仁殼較砂仁種子團力緩,如《藥籠小品》記載砂仁殼“辛香利氣,凡腹脹、瀉痢等癥,俱可用之,無砂仁燥竄之弊”。不同炮制方法對砂仁種子團和殼中成分的影響還未見報道。基于此,本文利用氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)開展了比較研究,以期探討砂仁不同炮制品與原藥材的差異成分。

在砂仁炒制過程中加入與鹽炙、姜炙相同體積的水,目的是為了排除水對姜炙、鹽炙砂仁結(jié)果的影響。本實驗通過考察不同炮制方法對砂仁藥材果皮及種子團中成分的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)49種差異成分中只在種子團中發(fā)生變化的成分有14種,只在果皮中發(fā)生變化的成分有22種,其他差異成分在不同炮制品中的種子團和果皮中均有顯著差異。與砂仁原藥材比較,炒制品有18種成分發(fā)生了顯著變化,種子團中成分改變的有9種,果皮中改變的成分有8種,種子團和果皮均改變的成分有1種,大多數(shù)成分趨勢為降低,而α-松油醇、乙酸龍腦酯、9-甲基-4-癸酮在炒制品果皮中升高,松油醇、甲酸龍腦酯在炒制品種子團中升高,(-)-α-側(cè)柏烯在種子團及果皮中均降低;姜炙品中有20種成分發(fā)生了變化,種子團中成分改變的有3種,果皮中改變的成分有16種,種子團和果皮均改變的成分1種,大多數(shù)差異性成分趨勢均為升高,而(-)-α-側(cè)柏烯、月桂烯、β-欖香烯、(E)-β-金合歡烯、(5Z,10Z)-5,10-十五烷醛在果皮中降低,香芹蒎酮、2-茨醇在種子團中降低,γ-松油烯在種子團及果皮中均升高;鹽炙品中有31種成分發(fā)生了變化,種子團中成分改變的有16種,果皮中改變的成分有13種,種子團和果皮均改變的成分2種,3,5-二甲基-4-辛烷、2,4- 二甲基癸烷、2-單棕櫚酸甘油在果皮中降低,在種子團中升高。盡管生姜中含有與砂仁相同的揮發(fā)性成分如莰烯、月桂烯、樟腦、水芹烯、松油醇、欖香烯、金合歡烯等,但砂仁經(jīng)姜炙后與砂仁原藥材比較其中莰烯、水芹烯、松油醇等沒有顯著差異,樟腦、γ-欖香烯在姜炙品果皮中含量增加,而金合歡烯、月桂烯等成分在姜炙品果皮中含量減少[8]。可見砂仁經(jīng)姜炙后兩者共有的揮發(fā)性成分變化趨勢不盡相同,盡管機制并不清楚,但體現(xiàn)了中藥炮制的復(fù)雜性。

《中藥炮制》中記載砂仁的炮制方法為“曬去灰塵,揀去雜質(zhì),同時打碎,若取其溫中止嘔則用姜汁炒,若取其補腎,用鹽水炒”。砂仁鹽炙后主歸腎經(jīng),辛溫之性略減,溫而不燥,并能引藥下行,增強理氣安胎、溫腎縮尿的作用,可用于妊娠惡阻,胎動不安[9]。砂仁不同炮制品在臨床中得到廣泛應(yīng)用,砂仁經(jīng)炒制后能夠提高其在妊娠嘔吐、理氣安胎方面的功效,炒姜后具有溫經(jīng)止血的功效,姜炙砂仁用于治療脾胃寒、腹痛腹瀉、出血[10]。

有研究表明意外攝入樟腦可造成嚴重的肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,常規(guī)使用也經(jīng)常會導(dǎo)致輕度肝神經(jīng)毒性,可能癥狀不明顯但還是具有一定的風(fēng)險[11],經(jīng)炒制、姜炙、鹽炙后,砂仁炮制品種子團中樟腦含量顯著降低,可見經(jīng)炮制后可能會提高砂仁的安全性。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)乙酸龍腦酯具有保胎、殺蟲、止瀉、抗炎、抗腫瘤、平滑肌運動、心血管活性、止痛、改善記憶等藥理作用[12],而炒制后砂仁果皮中乙酸龍腦酯含量顯著升高,但鹽炙及姜炙后并未發(fā)生顯著變化。除此以外,筆者還發(fā)現(xiàn)對人體具有潛在毒性的D-檸檬烯、蒎烯等成分經(jīng)炒制后,種子團中含量也明顯下降。但由于上述差異成分的活性研究較少,成分的差異是否是造成不同炮制品功能的差異還有待深入研究,盡管相關(guān)機制還不清楚,但也側(cè)面反映了砂仁炮制的科學(xué)性。

本實驗發(fā)現(xiàn)砂仁經(jīng)鹽炙后,較其他炮制方法比較烷烴類成分更容易發(fā)生顯著變化,其機制有待于進一步研究。此外,本文僅開展了不同炮制方法對砂仁成分的影響研究,如何結(jié)合砂仁炮制品的臨床功效,通過藥理實驗闡明不同炮制方法的科學(xué)性將是本課題組下一步開展的工作。