祖卡木顆粒對低氧性肺動脈高壓的藥效及機制研究*

劉芮綺,袁天翊,王冉冉,鄭瑞芳,龔迪菲,王守寶,,邢建國,杜冠華,方蓮花

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室,北京 100050;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室,北京 100050;3.新疆藥物研究所新疆維吾爾藥重點實驗室,烏魯木齊 830004)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種由于肺血管阻力增加,肺動脈壓力上升導(dǎo)致的病理生理障礙,其診斷標(biāo)準(zhǔn)為在海平面靜息狀態(tài)(不同的海拔高度可以換算為海平面),通過右心導(dǎo)管測量的平均肺動脈壓(mPAP)≥ 25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)[1]。PH的病因和發(fā)病機制復(fù)雜多樣,與許多個體和環(huán)境因素有關(guān),通常導(dǎo)致肺血管收縮、肺血管平滑肌異常增生和肺血管重構(gòu),最終導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡[2]。

目前根據(jù)不同的發(fā)病機制可將PH分為5類,其中第三類低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是由缺氧和肺部疾病導(dǎo)致的PH[3],主要包括慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、合并肺纖維化和肺氣腫、結(jié)節(jié)病、阻塞性睡眠呼吸暫停和高海拔導(dǎo)致的低通氣和缺氧相關(guān)的PH等[4]。在眾多刺激因素中,缺氧在HPH的產(chǎn)生與發(fā)展中起重要作用。通常由于高海拔或慢性缺氧肺疾病等導(dǎo)致缺氧,進而導(dǎo)致肺血管收縮,激活缺氧敏感的炎癥反應(yīng)和增殖途徑以及肺實質(zhì)的重塑和破壞[2]。病理特征包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、信號傳導(dǎo)異常、多細(xì)胞和血管的異常增生等[5]。這一過程導(dǎo)致更持續(xù)的血管阻力,引起右心室壓力升高及右心衰竭[6]。目前臨床治療方案包括靶向血管收縮和增殖的信號通路,但僅能緩解癥狀,很難逆轉(zhuǎn)右心室重構(gòu),因此尋找新的潛在治療藥物具有重要意義[7]。

祖卡木顆粒(Zukamugranules)作為一種維吾爾族的特色民族藥,具有調(diào)節(jié)異常氣質(zhì)及清熱、發(fā)汗、通竅等功效,用于治療感冒咳嗽、發(fā)熱無汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕等[8]。近年來對于其治療新型冠狀病毒肺炎等肺損傷疾病的研究提示,祖卡顆粒對于肺部具有一定的保護和抗炎治療作用[9],生物信息學(xué)研究亦顯示祖卡木復(fù)方可調(diào)控多條炎癥相關(guān)信號通路[10-12]。因此本文研究其對于肺動脈高壓的潛在防治作用,并開展了生物信息學(xué)研究、藥效學(xué)驗證以及其作用機制的探究。

1 材料與方法

1.1祖卡木主要成分篩選及靶點獲取 根據(jù)祖卡木

顆粒配方:山柰、睡蓮花、破布木果、薄荷、大棗、洋甘菊、甘草、蜀葵子、大黃、罌粟殼。通過Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP,http://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和Traditional Chinese Medicines Integrated Database(TCMID,https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database)兩個數(shù)據(jù)庫檢索收集全部主要成分[13-14]。口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-likeness,DL)是評價化合物在藥物代謝過程中的重要參數(shù),活性化合物的選擇參數(shù)設(shè)置為OB>30%,DL>0.18。其中,洋甘菊[15-16]、破布木果[17]和蜀葵子[18]的個別成分通過文獻(xiàn)中獲得,并利用TCMSP數(shù)據(jù)庫及PubChem數(shù)據(jù)庫檢索獲得化合物的SMILES號。基于結(jié)構(gòu)相似性原理在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中檢索化合物可能性大于0.1的靶點(http://www.swisstargetprediction.ch/)[19]。

1.2肺動脈高壓疾病相關(guān)靶點獲取 以“低氧性肺動脈高壓”為關(guān)鍵詞在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)中進行檢索[20-21],并去除其中的重復(fù)基因,篩選評分大于10的靶點。將活性成分靶點與HPH相關(guān)靶點的交集作為祖卡木顆粒治療HPH的潛在靶點[22]。

1.3中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)和靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.9.1進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析節(jié)點的度值、中心性、平均最短路徑等拓?fù)鋮?shù),并分析其中的主要節(jié)點信息。

1.4蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)通過蛋白質(zhì)之間的直接的物理相互作用和間接的功能相關(guān)性構(gòu)建祖卡木顆粒潛在靶點之間的交互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[23]。

1.5基因本體(gene ontology,GO)和京者基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 使用The Database for Annotation,Visualization,and Integrated Discovery (DAVID,https://david.ncifcrf.gov/home.jsp,ver.6.8)數(shù)據(jù)庫進行分析[24]。將主要成分與疾病相關(guān)的交集基因輸入,選擇物種為“人類”并分別進行生物過程、分子功能、細(xì)胞組成和KEGG途徑富集分析。將P值最小的前20項及其參數(shù)上傳到微生信(bioinformatics.com.cn)在線平臺中進行進一步的可視化分析。

1.6實驗驗證

1.6.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性C57BL16小鼠64只,體質(zhì)量約20～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。實驗動物于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng),恒溫(24～26 ℃)、恒濕(相對濕度30%～40%)環(huán)境,自由攝食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進行實驗。實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2019-0010,實驗動物使用許可證號SYXK(京)2019-0023,實驗動物倫理編號00004971。針對動物的所有實驗條件和實驗操作均符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物倫理委員會指導(dǎo)原則。

1.6.2藥品與試劑 西地那非(美國Selleck公司,純度:99.5%),以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制成10 mg·mL-1混懸液;祖卡木顆粒(新疆銀朵蘭藥業(yè)股份有限公司,生產(chǎn)批號:211214),以溫水配制成540 mg· mL-1溶液;Su5416(美國MCE公司,純度:99.96%),使用時將Su5416用二甲亞砜(DMSO,5%)+PEG300(40%)+聚山梨酯80(Tween80,5%)+超純水(50%)混合溶劑配制成2 mg·mL-1溶液;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.6.3儀器與設(shè)備 BL420S生物機能試驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);Millar微型壓力導(dǎo)管(美國MILLAR公司,r=82 mm);高速冷凍離心機(美國Beckman公司,Allegra X-22R,r=82 mm);SpectraMaxM5酶標(biāo)儀(美國MolecularDevices公司);Attendor 140 Pro低氧艙(廣州華粵行公司)。

1.6.4單純低氧兩周預(yù)防給藥實驗 在單純低氧兩周預(yù)防給藥模型中,將32只小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、西地那非組及祖卡木組,實驗方案如圖1所示。祖卡木組灌胃給予祖卡木顆粒混懸液5.4 g· kg-1,西地那非組灌胃給予西地那非溶液0.1 g· kg-1,正常對照組、模型對照組均灌胃給予等體積相應(yīng)溶劑。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)后,預(yù)防給藥3 d,每日1次。此后除正常對照組飼養(yǎng)在常氧環(huán)境中外,其余3組置低氧艙飼養(yǎng)2周,氧含量10%,期間每日給藥1次。使用模型為低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓經(jīng)典模型[25],給藥劑量由祖卡木顆粒說明書劑量換算得小鼠劑量。

圖1 單純低氧2周預(yù)防給藥實驗方案

1.6.5低氧4周+Su5416治療給藥實驗 分組及給藥劑量同“1.6.4節(jié)”。如圖2所示,動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,除正常組飼養(yǎng)在常氧環(huán)境中,其余3組置低氧艙飼養(yǎng)4周,氧含量10%,前2周每周皮下注射Su5416(20 mg· kg-1)1次。第3周起每日給藥1次。

圖2 低氧4周+Su5416治療給藥實驗方案

1.6.6稱重觀察 實驗過程中觀察小鼠狀態(tài)和死亡情況,記錄體質(zhì)量等指標(biāo)。

1.6.7實驗動物處理 實驗終點時用異氟烷麻醉小鼠,通過米勒導(dǎo)管測量右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP)并通過腹主動脈取血。將小鼠由腹部剪開至胸腔,打開胸腔暴露心臟,針頭由右心室心尖進入,用0.9%氯化鈉溶液進行灌注至灌洗液無明顯紅色、器官泛白為止。取小鼠心、肝、脾、肺、腎,用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,濾紙吸干水分,分析天平稱質(zhì)量,臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。沿心耳下緣將整個心室從心臟上剪下,沿心室間隔邊緣剪下右心室,稱量右心室(right ventricular,RV)及左心室加室間隔(left ventricular+septum,LV+S)質(zhì)量,計算RV/(LV+S),確定有無右心室肥厚。

1.6.8Masson染色觀察病理損傷情況 分離小鼠左肺,立即用鹽水沖洗,然后在4%多聚甲醛中固定24 h。在脫水和清除后,將肺包埋在石蠟中。石蠟包埋的組織用Masson染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片的形態(tài)變化,獲得顯微照片。

1.6.9蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting,WB)檢測蛋白表達(dá) 將小鼠肺組織剪碎并在冰上研磨,收集組織在1.5 mL離心管內(nèi),加入適量RIPA裂解液,經(jīng)組織勻漿和超聲處理后置于冰上繼續(xù)裂解直至裂解完全,經(jīng)4℃12 000 r·min-1離心20 min取上清。采用BCA蛋白濃度檢測法進行總蛋白定量。取總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜2 h,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。PVDF膜浸泡于5%脫脂牛奶(TBST配制)室溫下封閉2 h。以Bcl-2-相關(guān)X蛋白質(zhì)(Bcl-Associated X,Bax)(1：1 000)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma,Bcl-2)(1：1000)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidase synthase,eNOS)(1：1 000)、低氧誘導(dǎo)因子-1α亞基(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)(1：1 000)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)(1：1 000)、兔抗p-PI3K(1：1 000)、鼠抗β-actin(1：1 000)抗體進行孵育,4 ℃過夜。洗膜后,二抗與PVDF膜于室溫下作用2 h,再次洗膜。將發(fā)光液A和B等量混勻,在PVDF膜上滴加適量的ECL發(fā)光試劑,室溫下作用1 min,并使用全自動化學(xué)發(fā)光分析儀進行檢測。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism9.5版軟件作圖,one-way ANOVA進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1祖卡木顆粒活性成分和靶點的篩選 根據(jù)OB和DL等化合物的性質(zhì),從10種草藥中篩選出主要成分167個。其中山奈酚、柚皮苷、蘆薈大黃素、木犀草苷、光千金藤堿、藍(lán)堇堿、兒茶素、槲皮素、4-羥基苯甲酸、丁香酸同時存在于多種草本植物中。基于結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測可能性>0.1的靶點897個,低氧性肺動脈高壓疾病靶點去重后篩選評分>10的靶點701個,取交集后共同靶點179個。見圖3。

圖3 祖卡木顆粒主要活性成分靶點、HPH疾病靶點和共同靶點

2.2祖卡木顆粒中抗HPH相關(guān)成分與靶點的相互作用分析 利用Cytoscape軟件構(gòu)建了化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。如圖4所示,網(wǎng)絡(luò)由356個節(jié)點(主要成分10個、化合物167個和HPH相關(guān)靶點179個)和3 365個相互作用組成。外圈代表祖卡木處方中的各藥物及其主要成分,中間藍(lán)色矩形表示通過文獻(xiàn)及預(yù)測的祖卡木與HPH的共同靶點,連線表示其相互作用,節(jié)點越大、顏色越深表示該節(jié)點度值越大。結(jié)果表明,網(wǎng)絡(luò)中度參數(shù)較高的化合物包括山奈酚、木犀草苷、槲皮素、蘆薈大黃素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等,這些化合物可能在祖卡木的抗HPH作用中發(fā)揮更重要的作用。

圖4 祖卡木藥物-主要成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3構(gòu)建PPI與分析網(wǎng)絡(luò) 度值是指連接的鏈接數(shù)與相鄰節(jié)點數(shù),是反應(yīng)節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性的拓?fù)鋮?shù)。使用STRING工具構(gòu)建了祖卡木顆粒治療HPH的潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò),節(jié)點代表靶點,邊表示PPI的相互作用,節(jié)點的顏色強度與網(wǎng)絡(luò)中的度值成正比。如圖5所示,PI3KCA等關(guān)鍵靶點與其他靶點的相互聯(lián)系更強,也參與多種信號通路,可能在祖卡木的抗HPH作用中發(fā)揮更關(guān)鍵的作用。

圖5 祖卡木對HPH潛在靶點構(gòu)建PPI的網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)分析

2.4GO分析 利用DAVID平臺對祖卡木治療HPH中的潛在靶點進行富集分析,包括這些靶點參與的生物過程、分子功能、細(xì)胞組成KEGG途徑富集分析。點的大小表示富集目標(biāo)的數(shù)量,點的顏色代表基于P值的顯著性程度。如圖6-A所示,潛在的治療靶點參與多個生物過程,包括“低氧反應(yīng)”“藥物反應(yīng)”“激素反應(yīng)”;包括“血漿組成”“膜筏”在內(nèi)的細(xì)胞組成(圖6-B)以及“酶結(jié)合”“激酶活性”在內(nèi)的分子功能(圖6-C),提示低氧過程可能是疾病進展的重要因素。

A.生物過程;B.細(xì)胞成分;C.分子功能;D.KEGG分析圖。

2.5KEGG分析 為了進一步闡述靶點和通路之間的關(guān)系,使用KEGG數(shù)據(jù)庫和KEGG Mapper在線工具進行通路富集分析。顏色深淺表示不同的P值(P<0.05),而圓圈的大小表示數(shù)目。結(jié)果顯示,這些靶點主要參與增殖相關(guān)通路等(圖6-D)。

2.6實驗驗證結(jié)果

2.6.1單純低氧兩周預(yù)防給藥模型藥效學(xué)評價 實驗中觀察到模型對照組小鼠與正常對照組比較欠活潑,精神萎靡。如圖7-A所示,預(yù)防給藥階段3組小鼠的體質(zhì)量均呈逐漸增加,其中祖卡木組的上升趨勢最為明顯。進入低氧環(huán)境后,3組小鼠體質(zhì)量均明顯降低。與模型對照組比較,西地那非與祖卡木對體質(zhì)量無明顯改善。

①與正常對照組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.01;③與模型對照組比較,P<0.05。

RVSP是檢測肺動脈高壓的金指標(biāo)[26]。如圖7-B及7-C所示,與正常對照組比較,模型對照組小鼠RVSP顯著升高(35.79 mmHgvs.25.43 mmHg,P<0.01)。與模型對照組比較,西地那非組(27.90 mmHgvs.35.79 mmHg,P<0.01)與祖卡木組(29.78 mmHgvs.35.79 mmHg,P<0.05)RVSP均顯著下降。小鼠的右心室指數(shù)和心臟指數(shù)是評價心室重構(gòu)的重要指標(biāo)。與正常對照組比較,模型對照組右心室指數(shù)顯著增加(P<0.01),模型對照組西地那非組與祖卡木組比模型對照組顯著降低(P<0.05)。與正常對照組比較,模型對照組和西地那非組的心臟指數(shù)(圖7-F)和心室指數(shù)(圖7-E)有輕微增加,而祖卡木組輕微下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

不同臟器指數(shù)可以作為評價藥物調(diào)節(jié)作用的重要指標(biāo)。肺指數(shù)通常可代表肺性病變的嚴(yán)重程度,由于炎性滲出等原因使肺重量增大,肺指數(shù)越大提示肺病變越嚴(yán)重。如圖7-G至7-J顯示,與正常對照組比較,模型對照組的肺指數(shù)顯著升高(P<0.02)。與模型對照組比較,西地那非組與祖卡木組的肺指數(shù)僅輕微降低,無明顯變化。脾臟是體內(nèi)免疫的中樞,西地那非組與正常對照組比較脾指數(shù)明顯降低,而祖卡木組比西地那非組明顯升高。肝指數(shù)與腎指數(shù)均無明顯影響。

2.6.2低氧4周+Su5416治療給藥模型藥效學(xué)評價 如圖8-A所示,當(dāng)對模型對照組、西地那非組和祖卡木組進行低氧加皮下注射Su5416后,3組小鼠體質(zhì)量明顯下降。給藥后祖卡木組體質(zhì)量水平與其他兩組比較上升趨勢最為明顯。

①與正常對照組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.01;③與模型對照組比較,P<0.05。

將小鼠肺組織固定、包埋、切片,Masson染色法觀察肺組織尤其是肺動脈血管病理變化(圖8-C)。與正常對照組比較,模型對照組小鼠肺血管明顯增厚(P<0.01),西地那非組和祖卡木組肺部病理狀態(tài)有所改善(P<0.01)。

如圖8-B及8-E所示,與正常對照組比較,模型對照組小鼠RVSP顯著升高(29.07 mmHgvs.22.18 mmHg,P<0.01)。與模型對照組比較,西地那非組與祖卡木組RVSP均顯著下降(25.84 mmHgvs.29.07 mmHg,22.93 mmHgvs.29.07 mmHg,P<0.01),提示兩者對肺動脈高壓均有一定治療效果,且祖卡木效果優(yōu)于陽性藥西地那非。與正常對照組比較,模型對照組右心室指數(shù)顯著上升(P<0.01),右心室指數(shù)祖卡木組與模型對照組比較,顯著下降(P<0.05),提示祖卡木對于減緩肺高壓引起的右心室重構(gòu)有一定作用。與模型對照組比較,西地那非組右心室指數(shù)也有一定降低(圖8-F)。對于心重指數(shù)和心室指數(shù),4組均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(圖8-G及8-H)。

圖8-I至8-L顯示,與正常對照組比較,其余3組的肺指數(shù)顯著升高;與模型對照組比較,祖卡木組的肺指數(shù)有所降低。而對于脾指數(shù),與正常對照組比較,模型對照組脾指數(shù)明顯降低,西地那非組與祖卡木組均有所回升。

2.6.3祖卡木下調(diào)肺組織中Bcl-2的表達(dá)并上調(diào)Bax的表達(dá) 為了探討祖卡木對缺氧誘導(dǎo)的血管重構(gòu)保護作用的可能機制,本研究檢測了肺組織中Bcl-2以及Bax的蛋白水平。結(jié)果表明,缺氧可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)并下調(diào)Bax的表達(dá)(P<0.01),而西地那非和祖卡木可以有效逆轉(zhuǎn)這一情況(P<0.05),見圖9。

①與正常對照組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.05;③與模型對照組比較,P<0.01;④與正常對照組比較,P<0.01。

2.6.4祖卡木上調(diào)肺組織中PI3K及eNOS的表達(dá)并降低HIF-1α的表達(dá) PI3K是具有磷脂酰肌醇激酶活性的二聚體,由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成[27]。NOS分為三類:內(nèi)皮型NOS (endothelial NOS,eNOS )、誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS,iNOS)、神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS,nNOS)。實驗使用Western blotting方法檢測了小鼠肺組織中PI3K亞基p85、磷酸化p85、eNOS及HIF-1α的蛋白表達(dá)水平。圖10所示,與正常對照組比較,模型對照組p85、p-p85及eNOS的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),HIF-1α的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。西地那非和祖卡木均可以顯著上調(diào)p85、p-p85及eNOS的表達(dá)水平并下調(diào)HIF-1α的表達(dá)(P<0.01)。

①與正常對照組比較,P<0.01;②與模型對照組比較,P<0.01;③與模型對照組比較,P<0.05。

3 討論

祖卡木顆粒作為我國民族藥的重要瑰寶,在治療上呼吸道疾病以及急性肺損傷等疾病中發(fā)揮了重要作用。既往研究主要集中在其對于呼吸道感染及肺部疾病的抗炎和免疫治療作用,而缺乏對于HPH的防治研究及其可能機制的探討[28-29]。本研究首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析手段對祖卡木顆粒中的主要生物活性化合物、潛在靶點和信號通路進行分析,預(yù)測其可能的分子作用機制,并在動物體內(nèi)進行預(yù)防及治療實驗藥效的初步驗證,最后通過分子生物學(xué)分析驗證其發(fā)揮作用的潛在信號通路,首次發(fā)現(xiàn)了祖卡木顆粒對于HPH的防治作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了多組分和多靶點網(wǎng)絡(luò)圖,更好地闡明了疾病和藥物相關(guān)的基因靶點相互關(guān)系。通過PPI富集結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)PIK3CA、HIF-1等基因可能是祖卡木顆粒作用的關(guān)鍵靶點。PIK3CA的激活突變在許多疾病中常見,導(dǎo)致PI3K活性增加、下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強、細(xì)胞增殖和腫瘤生長[30]。此外,GO和KEGG分析預(yù)測祖卡木顆粒的潛在作用機制可能與低氧及增殖相關(guān)信號通路有關(guān),為后續(xù)實驗驗證及信號通路的選擇提供了理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn),PI3K可以調(diào)控HIF-1α的表達(dá),缺氧誘導(dǎo)因子作為肺缺氧反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,與HPH的發(fā)病機制相關(guān)[31]。HIF-1α可進一步調(diào)節(jié)參與糖代謝和血管生成的下游蛋白的表達(dá),如血管內(nèi)皮生長因子等。缺氧條件啟動HIF-α亞基與HIF-β亞基的核轉(zhuǎn)位和結(jié)合,而激活的HIF通過誘導(dǎo)或抑制廣泛的基因參與調(diào)節(jié)血管張力、血管生成、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞代謝、增殖、存活和自噬反應(yīng),從而啟動對缺氧的適應(yīng)性反應(yīng),因此在PH病理狀態(tài)下HIF-α表達(dá)量增高[32]。

此外,PI3K屬于脂質(zhì)激酶家族,其特點是能夠磷酸化質(zhì)膜中肌醇磷脂中的肌醇環(huán)3'-OH基團[33]。eNOS是內(nèi)皮細(xì)胞合成NO所必需,PI3K-eNOS信號通路在各種細(xì)胞遷移增殖、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)中起著重要作用,且eNOS受PI3K的調(diào)控。HIF-1α被認(rèn)為與氧水平密切相關(guān)并激活PI3K通路,而NO在無氧情況下有助于HIF-1α的穩(wěn)定[34]。在包括木樨草素、桔梗湯、丹參酮IIA等多種復(fù)方藥物及天然產(chǎn)物對于PH及其他肺部疾病的研究中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt-eNOS及HIF-Arg-NO途徑是藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路[35-37]。

肺動脈重塑與肺動脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和凋亡抑制有關(guān),eNOS也被證明通過抑制促凋亡蛋白在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[34]。細(xì)胞凋亡是在生理或病理條件下細(xì)胞自發(fā)死亡的過程,在細(xì)胞發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用[38]。其中Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白,而Bax是一種促凋亡蛋白,增強線粒體凋亡通路,抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖可以改善PH[39],也是許多針對PH中血管增殖重構(gòu)的藥物研究的經(jīng)典通路[40]。根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果,預(yù)測祖卡木治療肺高壓的潛在靶點可能與缺氧及增殖相關(guān)通路最為密切,且PI3K可能作為一個核心靶點。因此我們選擇PI3K作為核心靶點,探究其下游兩個通路(HIF-1α及eNOS)以及增殖相關(guān)通路Bax/Bcl進行進一步驗證。

本研究選擇單純低氧2周與低氧4周+Su5416 2個動物模型進行藥效學(xué)探究。單純低氧2周小鼠模型可模擬突發(fā)性低氧所致機體障礙,是快速評價治療HPH藥物效果的首選模型,因此選擇其作為藥效初篩模型。Su5416是一種血管新生抑制劑,能抑制低氧所致肺血管新生,低氧合并Su5416模型可加重小鼠肺血管損傷,與臨床患者病理表現(xiàn)相近,可作為長期藥效評價模型[25]。在2個模型中均驗證了祖卡木顆粒對于HPH的預(yù)防及治療作用,其可以顯著降低RVSP,明顯減輕小鼠右心室肥厚,效果優(yōu)于陽性藥西地那非。

為了探究祖卡木顆粒對HPH治療作用的分子機制,本研究檢測了肺組織中相關(guān)信號通路的變化。研究結(jié)果顯示,祖卡木可下調(diào)肺組織中Bcl-2的表達(dá)并上調(diào)Bax的表達(dá),提示祖卡木可能通過抑制細(xì)胞的增殖發(fā)揮治療作用,此外可上調(diào)肺組織中PI3K及eNOS的表達(dá)并降低HIF-1α的表達(dá),提示激活PI3K-eNOS及抑制HIF-1α信號通路可能是祖卡木發(fā)揮治療作用的潛在機制。本研究可以為祖卡木顆粒的基礎(chǔ)研究以及臨床應(yīng)用提供思路和拓展,也為HPH的臨床治療提供潛在的治療藥物。但目前這些結(jié)果只是祖卡木顆粒作用機制的線索,后續(xù)還應(yīng)采用Bax/Bcl及PI3K/Akt抑制劑等對該通路進行干預(yù)以確證祖卡木顆粒的作用機制。

綜上所述,論文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段分析預(yù)測了民族藥祖卡木顆粒治療HPH的作用靶點,并通過兩種實驗動物模型進行了藥效學(xué)驗證及分子生物學(xué)分析。首次揭示了祖卡木顆粒可能通過Bax/Bcl及PI3K-eNOS/HIF-1α通路對HPH起到治療作用,為后續(xù)開發(fā)新的治療藥物及拓展祖卡木顆粒適應(yīng)證提供了新的選擇。