雙路通腦方調節SIRT1/Nrf2/GPx4信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經元鐵死亡的影響*

鄭光珊,翟陽,王凱華,馬威,梅小平,陳瑩,鄒敏,龐延,楊鵬,呂艷

(1.廣西國際壯醫醫院腦病科,南寧 530200;2.廣西中醫藥大學教務處,南寧 530200;3.廣西國際壯醫醫院康復科,南寧 530200;4.廣西國際壯醫醫院兒科,南寧 530200;5.廣西中醫藥大學第一附屬醫院急診科,南寧 530200;6.廣西國際壯醫醫院科技部,南寧 530200;7.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腦病科,南寧 530011)

缺血性腦卒中是腦卒中最常見類型,主要是因腦部血液供應減少以及腦動脈血栓栓塞性閉塞引起,進而產生細胞應激引發興奮性毒性、氧化應激和線粒體紊亂,影響患者預后[1-2]。溶栓劑治療是目前急性期最主要的治療方法,但其治療時間窗較窄。盡管新興血管內血栓切除術可延長治療時間窗,但仍有許多患者錯過了血管重建的最佳時間[3]。鐵死亡是一種鐵依賴性氧化應激誘導的細胞死亡,其特征是由鐵依賴性催化機制誘導的致死性脂質氫過氧化物的積累,進而導致神經元死亡,現代研究表明其對缺血性腦卒中具有重要作用[4-5]。谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)是鐵死亡的關鍵調節因子,在脂質過氧化物轉化為無毒脂質中起著至關重要的作用[6]。沉默信息調節因子2同源物1(silent information regulator 2 homolog 1,SIRT1)是一種NAD依賴性蛋白脫乙酰酶,被認為是細胞抵抗氧化應激損傷的保護因子[7]。SIRT1可通過介導核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)及其下游靶標的表達來消除脂質過氧化的影響,驅動抗氧化防御系統,同時誘導并參與GPx4的合成,進而抑制鐵死亡[8]。研究表明上調SIRT1能夠增加Nrf2和GPx4表達,減輕鐵死亡,進而減輕缺氧缺血性腦損傷[9]。雙路通腦方由廣西國際壯醫醫院在壯藥壯通飲的基礎上自主研發而成,是具有地方民族特色的院內協定處方,由桂枝尖、陳皮、茯苓、蒼術、南山楂、生姜、扶風藤、黃花倒水蓮、田七、法半夏和炙甘草組方而成,具有疏通龍路、火路之毒邪瘀滯之效。臨床研究表明雙路通腦方對缺血性腦卒中急性期和恢復期患者療效顯著,同時能夠提高患者生活質量[10],但其作用機制尚未明確。因此,本研究旨在探討雙路通腦方能否通過調控SIRT1/Nrf2/GPx4信號通路來改善缺血性腦卒中的神經元鐵死亡。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠90只,6周齡,體質量180～210 g,購自廣西醫科大學,實驗動物許可證號:SCXK(湘)2019-0004。將大鼠飼養在溫度24～26 ℃,相對濕度55%～65%,且12 h光照和12 h黑暗交替的環境中。本研究經廣西中醫藥大學倫理委員會批準(倫理審查批件:DW20210612-063)。

1.2主要試劑和儀器 雙路通腦方(批號:20210901,每克相當于原藥材5 g,成人每天3次,每次0.8 g[10])來源于廣西國際壯醫醫院,方中11味中藥配方顆粒經本院藥房檢驗均符合規定要求;EX527(SIRT1抑制劑,批號:HY-15452)購自美國Med Chem Express;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyte-trazoliumchloride,TTC)染色液(購自北京凱詩源生物科技有限公司,批號:SH-0453);蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液(批號:YT8310)、尼氏染色液均購自北京伊塔生物科技有限公司(批號:YT8911);鐵(Fe2+)含量檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司(批號:SNM159);大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司(批號:EK-R37032、EK-R38818);大鼠丙二醛(malonaldehyde,MDA)ELISA檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司(批號:EKF60082);酰基-輔酶a合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)兔單抗(批號:ab155282)、鐵蛋白重鏈多肽1(FTH1)兔單抗(批號:ab183781);轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)小鼠單抗(批號:ab269513)、SIRT1兔單抗(批號:ab189494)、GPx4兔單抗(批號:ab125066)、胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白(cystine/glutamate antiporter solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)兔單抗均購自英國abcam公司(批號:ab175186);Nrf2兔多抗購自上海愛必信生物科技有限公司(批號:abs146223);山羊抗兔(批號:33101ES60)、山羊抗小鼠(批號:33220ES60)均購自上海翌圣生物科技股份有限公司。

KJ-2V7M型超聲經顱多普勒血流分析儀(南京科進實業有限公司);Thermo熱電FC酶標儀(上海聯邁生物工程有限公司;奧林巴斯倒置顯微鏡CKX53(上海普赫光電科技有限公司);ChemiDoc MP System全能型成像系統(上海伯樂生命醫學產品有限公司)。

1.3方法

1.3.1大鼠模型制備 先在所有大鼠中采用隨機數字表法選取20只作為假手術組,剩余70只大鼠均參照文獻[11]采用大腦中動脈閉塞法制備缺血性腦卒中大鼠模型。24 h后,根據Zea-Longa方法[12]進行評分,評分標準如下:0分:無異常癥狀;1分:缺血對側前肢無法伸直;2分:行走時易向缺血對側轉圈;3分:行走時易向缺血對側跌倒;4分:不能進行自主意識的活動。評分越高表明神經損傷程度越大。評分在1～3分的大鼠則為造模成功,造模成功率為85.71%。假手術組大鼠只暴露頸動脈,并不進行結扎。

1.3.2分組及給藥 將造模成功的60只大鼠利用隨機數字表法分為模型對照組、雙路通腦方組、雙路通腦方+SIRT1抑制劑組(雙路通腦方+EX527組),每組20只。取雙路通腦方適量,用注射用水溶解制成雙路通腦方水溶液。雙路通腦方組大鼠根據劑量換算公式[大鼠劑量=6.3×(0.4×2×3)g/70 kg=0.216 g·kg-1]按0.216 g·kg-1灌胃給予雙路通腦方水溶液[10];雙路通腦方+EX527組大鼠在灌胃雙路通腦方水溶液之前腹腔注射10 mg·kg-1的SIRT1抑制劑EX527[13]。假手術組和模型對照組大鼠均以相同方式給予等體積的生理鹽水。每天給藥1次,共持續14 d。末次給藥結束后,根據“1.3.1節”中的Zea-Longa評分評估各組大鼠神經損傷情況。

1.3.3TTC染色檢測大鼠腦梗死面積 神經功能評分后,每組選取5只大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后處死,在無菌條件下解剖大腦并獲取完整腦組織。將腦組織切成冠狀切片厚2 mm,然后浸入2% TTC溶液中,在室溫下避光孵育20 min。使用照相機對腦切片進行拍照,并利用Image J軟件測量和分析梗塞面積。

1.3.4HE染色檢測大鼠腦組織病理情況 每組取5只大鼠按照“1.3.3節”方法獲取腦組織后,立即固定于4%多聚甲醛中,24 h后將大腦組織進行石蠟包埋,并切成5 μm厚的切片。然后將石蠟切片在二甲苯中脫蠟,并利用梯度乙醇再水合,用蘇木素-伊紅染色。之后將組織切片分別使用梯度乙醇和二甲苯進行脫水透明,PBS清洗后中性樹脂封片,最后在顯微鏡下觀察缺血側腦組織的病理變化。

1.3.5尼氏染色檢測大鼠腦組織神經元數量 取“1.3.4節”中的石蠟切片脫蠟水化后,放入尼氏染色溶液中,在37 ℃下浸泡5 min。然后按照方法進行脫水、透明和封片。在光學顯微鏡下觀察尼式體的染色情況,并利用Image J軟件分析尼式體染色陽性的神經元數量。

1.3.6檢測大鼠腦組織中Fe2+、SOD、GSH、MDA的水平 將剩余大鼠全部麻醉處死后取缺血側腦組織,PBS清洗后,每組取5只進行稱體質量,然后加入液氮研磨成粉末,并按照1：9(W/V)的比例加入預冷的PBS進行勻漿,在4 ℃,2 500 r·min-1(離心半徑10 cm)下離心10 min,收集上清液。剩余組織凍存至-80 ℃。先利用比色法檢測上清液中的Fe2+含量,然后再按照SOD、GSH、MDA試劑盒制備標準曲線,用酶標儀檢測上清液在450 nm處的吸光度,并根據標準曲線計算SOD、GSH、MDA的含量。

1.3.7免疫組化檢測大鼠腦組織中ACSL4、TFR、FTH1蛋白的陽性表達 取“1.3.4節”中的腦組織石蠟切片進行脫蠟,將脫蠟后的切片在抗原修復緩沖液(0.01 M檸檬酸溶液,pH 6.0)中煮沸20 min,以促進抗原修復。然后,將切片冷卻至室溫后用3% H2O2溶液處理30 min,阻斷內源過氧化物酶的活性。隨后,將切片置于含1% BSA的PBS中孵育30 min,與ACSL4(1：250)、TFR(1：2 000)、FTH1(1：400)抗體稀釋液在4 ℃下孵育過夜,與羊抗兔或羊抗小鼠二抗(1：500)在室溫下孵育1 h,用DAB染色,蘇木精復染。用光學顯微鏡觀察切片染色情況,棕黃色表示陽性蛋白表達,利用Image Pro Plus軟件測量每張圖片的累積光密度值和區域面積,并計算平均光密度值(A)來反映目標蛋白在單位面積內的表達情況。

1.3.8Western blotting法檢測大鼠腦組織中SIRT1、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白的表達 取“1.3.6節”中凍存的腦組織,加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白質。將煮沸變性后的蛋白樣品通過10% SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,然后用SIRT1、Nrf2、GPx4、SLC7A11一抗稀釋液(稀釋比例1：1 000)在4 ℃下孵育過夜,再在室溫下與山羊抗兔(1：5 000)二抗共孵育1 h,最后用ECL試劑顯影,在凝膠成像系統中攝像。然后以GAPDH為內參,用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1雙路通腦方對大鼠神經功能缺損的影響 4組大鼠神經功能缺損評分比較,差異均具有統計學意義(F=1 895.275,P<0.05);與假手術組比較,模型對照組大鼠的神經功能缺損評分升高(P<0.05);與模型對照組比較,雙路通腦方組大鼠的神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05);與雙路通腦方組比較,雙路通腦方+EX527組大鼠的神經功能缺損評分升高(P<0.05),見圖1。

①與假手術組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.05;③與雙路通腦方組比較,P<0.05。

2.2雙路通腦方對大鼠腦梗死面積的影響 4組大鼠腦梗死面積比較,差異均具有統計學意義(F=362.517,P<0.05);與假手術組比較,模型對照組大鼠的腦梗死面積增大(P<0.05);與模型對照組比較,雙路通腦方組大鼠的腦梗死面積減小(P<0.05);與雙路通腦方組比較,雙路通腦方+EX527組大鼠的腦梗死面積增大(P<0.05),見圖2。

A.TCC染色檢測大鼠腦梗死面積;B.測量大鼠腦梗死面積(白色區域)。①與假手術組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.05;③與雙路通腦方組比較,P<0.05。

2.3雙路通腦方對大鼠腦組織病理損傷的影響 假手術組大鼠腦組織結構完整,神經元形態正常;與假手術組比較,模型對照組大鼠神經元排列不規則,細胞間隙變大,細胞核固縮;與模型對照組比較,雙路通腦方組大鼠神經元排列恢復整齊,細胞間隙縮小,細胞核固縮減輕;與雙路通腦方組比較,雙路通腦方+EX527組大鼠神經元損傷加重,與模型對照組相似,見圖3。

圖3 HE染色檢測各組大鼠腦組織的病理形態(×200)

2.4雙路通腦方對大鼠神經元損傷的影響 4組大鼠神經元數量比較,差異均具有統計學意義(F=314.553,P<0.05);與假手術組比較,模型對照組大鼠神經元數量減少(P<0.05);與模型對照組比較,雙路通腦方組大鼠神經元數量增加(P<0.05);與雙路通腦方組比較,雙路通腦方+EX527組大鼠神經元數量減少(P<0.05),見圖4。

A.Nissl染色大鼠神經元(×200);B.統計神經元染色數量。①與假手術組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.05;③與雙路通腦方組比較,P<0.05。

2.5雙路通腦方對大鼠腦組織中Fe2+、MDA、SOD、GSH水平的影響 4組大鼠腦組織中Fe2+、MDA、SOD、GSH水平比較,差異均具有統計學意義(F=158.191、96.975、160.186、124.947,均P<0.05);與假手術組比較,模型對照組大鼠腦組織中Fe2+和MDA水平升高,SOD、GSH水平降低(P<0.05);與模型對照組比較,雙路通腦方組大鼠腦組織中Fe2+和MDA水平降低,SOD、GSH水平升高(P<0.05);與雙路通腦方組比較,雙路通腦方+EX527組大鼠腦組織中Fe2+和MDA水平升高,SOD、GSH水平降低(P<0.05),見圖5。

①與假手術組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.05;③與雙路通腦方組比較,P<0.05。

2.6雙路通腦方對各組大鼠腦組織中ACSL4、TFR、FTH1蛋白表達的影響 4組大鼠腦組織ACSL4、TFR、FTH1蛋白表達比較,差異均具有統計學意義(F=30.000、53.611、99.872,均P<0.05);與假手術組比較,模型對照組大鼠腦組織中ACSL4、TFR表達升高,FTH1表達降低(P<0.05);與模型對照組比較,雙路通腦方組大鼠腦組織中ACSL4、TFR表達降低,FTH1表達升高(P<0.05);與雙路通腦方組比較,雙路通腦方+EX527組大鼠腦組織中ACSL4、TFR表達升高,FTH1表達降低(P<0.05),見圖6。

A.ACSL4、TFR、FTH1蛋白的免疫組化染色;B.ACSL4、TFR、FTH1蛋白的平均吸光度值。①與假手術組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.05;③與雙路通腦方組比較,P<0.05。

2.7雙路通腦方對各組大鼠腦組織中SIRT1、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達的影響 4組大鼠腦組織中SIRT1、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達比較,差異均具有統計學意義(F=250.118、228.214、439.856、405.889,均P<0.05);與假手術組比較,模型對照組大鼠腦組織中SIRT1、Nrf2、GPx4和SLC7A11蛋白表達降低(P<0.05);與模型對照組比較,雙路通腦方組大鼠腦組織中SIRT1、Nrf2、GPx4和SLC7A11蛋白表達升高(P<0.05);與雙路通腦方組比較,雙路通腦方+EX527組大鼠腦組織中SIRT1、Nrf2、GPx4和SLC7A11蛋白表達降低(P<0.05),見圖7。

①與假手術組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.05;③與雙路通腦方組比較,P<0.05。

3 討論

缺血性腦卒中是最常見的腦卒中,其特征是腦血管閉塞導致的腦部血液和氧氣供應不足,進而在缺血性腦組織中發生一系列有害的級聯反應,包括活性氧積累、免疫細胞浸潤、血腦屏障破壞以及神經元的不可逆壞死,增加患者發生神經功能障礙的風險[14-15]。因此,需要制定新的治療策略,以有效促進神經功能恢復并減輕繼發性再灌注損傷。本研究結果顯示,模型對照組大鼠神經功能缺損評分和腦梗死面積均高于假手術組,提示大鼠模型復制成功。而雙路通腦方組大鼠的神經功能缺損評分和腦梗死面積較模型對照組降低,揭示了雙路通腦方可以降低缺血性腦卒中大鼠的神經功能障礙并抑制腦組織梗死。隨后,進一步通過HE和尼氏染色觀察神經元的病理損傷情況,結果顯示,模型對照組大鼠腦組織神經元數量減少,神經元損傷嚴重,雙路通腦方組大鼠腦組織神經元數量增加,神經元損傷減輕,揭示了雙路通腦方能夠減輕缺血性腦卒中大鼠的神經元損傷。

缺血性腦卒中的發病機制比較復雜,其特征主要是活性氧的過度產生、細胞外興奮性氨基酸和谷氨酸水平的顯著增加,以及氧化應激和神經炎癥的激活[16]。最近,鐵死亡被證明是一種氧化程序性細胞死亡,可能是由于鐵離子積累誘導的過度脂質過氧化和GSH的減少引起的抗氧化防御系統失衡,最終導致細胞氧化死亡[17],目前已有大量研究證明了鐵死亡在缺血性腦卒中引起的神經元死亡中發揮重要作用[18]。因此,本研究探討了雙路通腦方對神經元鐵死亡的調節作用。已知有多種蛋白質參與調節鐵死亡,包括ACSL4、TFR和FTH1,ACSL4催化長鏈多不飽和脂肪酸的乙酰化,產生脂質過氧化物,最后促進鐵死亡[19]。TFR通過轉鐵蛋白內吞途徑來吸收鐵,增加鐵在細胞內的積累,而FTH1則與細胞內過量的游離鐵形成鐵蛋白復合物并以無毒形式儲存[20]。結果發現,與模型對照組比較,雙路通腦方組大鼠腦組織中的Fe2+和脂質過氧化產物MDA的含量降低,抗氧化酶SOD和GSH含量升高,鐵死亡標志蛋白ACSL4、TFR表達降低,FTH1表達升高,提示雙路通腦方能夠抑制缺血腦卒中大鼠Fe2+的積累和過度的脂質過氧化,促進鐵離子形成鐵蛋白復合物,進而抑制神經元鐵死亡。但其作用機制還需進一步了解。

SIRT1作為一種高度保守的NAD+依賴性脫乙酰酶,在細胞代謝、衰老、凋亡、炎癥反應和氧化應激等過程中起著關鍵的調節作用,Nrf2是細胞內抗氧化蛋白的主要轉錄調節因子,其通過調節下游抗氧化基因血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)表達來降低ROS水平,以防止氧化應激誘導的組織損傷[21]。有研究已經表明SIRT1/Nrf2信號通路可以通過抑制氧化應激來減輕腦缺血再灌注損傷[22]。而最近在另一項研究中發現,Nrf2和HO-1都可以誘導并參與鐵死亡中樞抑制劑GPx4的合成,同時也會增加FTH1、SLC7A11等其他下游因子的表達,從而影響鐵死亡途徑[6,23]。其中SLC7A11也是GPx4的還原底物GSH合成半胱氨酸的主要來源。本研究結果顯示,雙路通腦方組大鼠腦組織中SIRT1、Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白表達均高于模型對照組,提示雙路通腦方能夠激活缺血性腦卒中大鼠中的SIRT1/Nrf2/GPx4信號通路。EX527是一種新型、選擇性SIRT1小分子抑制劑,有研究顯示,在小鼠抑郁模型中,EX527的加入消除了依拉達奉的抗抑郁作用,并抑制Sirt1/Nrf2/HO-1/Gpx4 通路中的蛋白水平[24]。因此,本研究為了進一步探索該通路在雙路通腦方抑制神經元鐵死亡過程中的作用,使用SIRT1抑制劑進行回補實驗,結果顯示SIRT1抑制劑逆轉了雙路通腦方對神經元鐵死亡的抑制作用,同時也抑制了Nrf2和GPx4的表達,進一步揭示了雙路通腦方對缺血性腦卒中大鼠神經元鐵死亡的抑制作用可能與SIRT1/Nrf2/GPx4信號通路被激活有關。

綜上所述,雙路通腦方可能通過激活SIRT1/Nrf2/GPx4信號通路來抑制缺血性腦卒中大鼠神經元鐵死亡。本研究通過動物實驗進一步證實了雙路通腦方對缺血性腦卒中存在潛在的治療作用,并為臨床應用提供理論依據。與其他研究藥物比較,本研究中藥方成本較低,且無毒副作用,可以作為腦卒中的治療藥物推廣。但目前對雙路通腦方的功效主治、適應證尚未能完全明確,工藝及質量標準優化也不完全,對每味藥材的質量標準及藥理藥性研究不充分,因此該藥方的具體應用及推廣還需更多的研究支持和驗證。本研究通過HE染色、尼氏小體染色從病理學角度驗證雙通路腦方對腦卒中神經元死亡的恢復作用,同時采用行為學評估、腦梗死面積等指標對雙通路腦方藥效學進行評價,評價指標還不夠全面,后續將補充更多的評價指標進一步對雙路通腦方藥效學進行深入研究。