褐藻聚合酚下調TGF-β1/Smads信號通路抑制大腸癌細胞增殖與侵襲*

李紅,董瑋,侯杰,賀德

(深圳市寶安區人民醫院普通外科,深圳 518000)

流行病學結果顯示,大腸癌(主要包括結腸癌和直腸癌)的發病率居消化道惡性腫瘤第二位,嚴重威脅著我國居民的生命健康[1-2]。隨著生命科學、醫學技術的高速發展,以及個體化靶向干預手段在臨床應用的推廣,極大地提高了患者的生命質量,其中天然藥物尤其源自海洋的海洋藻類植物成為國內外眾多研究學者的研究熱點[3]。LI 等[4]研究報道褐藻中多酚類具有明顯的抗氧化、抗炎性以及抗腫瘤增殖等藥理活性。BLESSIE等[5]研究顯示海洋褐藻的提取物能明顯抑制肝癌HepG2細胞的增殖。轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及母體抗生物皮膚生長因子同源物2/3(mothers against decapentaplegic homolog 2/3,Smad2/3)信號是一條內源性的與腫瘤發生、發展關系密切的通路[6]。研究顯示該信號在胃癌、食管癌等消化道惡性腫瘤中表達異常,并且異常表達的TGF-β1直接增強Smad2/3的磷酸化,增強癌細胞的增殖與侵襲能力[7]。PEREZ等[8]研究顯示在結腸炎相關的結腸癌小鼠中,抑制TGF-β1信號能明顯降低模型動物中結腸的成瘤數目。本研究以結腸癌細胞HT29為研究對象,從TGF-β1/ Smads信號入手,探討海洋褐藻的主要組分褐藻聚合酚(phlorofucofuroeckol A,PFFE-A)對腫瘤細胞的體內外增殖與侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1細胞、動物及主要試劑和儀器 腸癌細胞株HT29購自國家生物醫學實驗細胞資源庫。C57BL/6雄性裸鼠,SPF級,4～5周齡,體質量18～22 g,32只。購自廣州藥康生物科技有限公司,動物生產許可證號:SCXK(粵)2020-0054;倫理編號19-08-11HTREW-01。以基礎標準飼料,自由攝食與飲水,在溫度(23 ℃～25 ℃),濕度(45%～55%),12 h/12 h明暗交替下進行適應性喂養。PFFE-A(純度≥99.9%,批號:CHO-JL92)購自美國Fisher Scientific公司。5-乙炔基-2'脫氧尿苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)染色試劑盒,購自美國Abbiotec公司(批號:AHI-239PD);Transwell小室(批號:CAMF-08ND)購自美國Corning公司;Trizol試劑(批號:TH03-KGF483)、逆轉錄試劑(批號:TH03-DNS327)購自美國Thermo公司;TGF-β1(批號:ROG94-VM649)、p-Smad2/3(批號:ROG37-CH056)抗體購自美國Roche公司;TGF-β1信號激動劑重組人TGF-β1(批號:2021-06-EV004)購自美國Santa Cruz公司。LRH-70F型二氧化碳細胞培養箱(美國BioTek公司),IX71型Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司),電泳槽(型號:Mini-PRO-2100)、電泳儀(型號:JMR-27020)購自美國Cayman公司。

1.2細胞分組處理 取對數生長期的HT29細胞進行實驗,分為正常對照組,PFFE-A小劑量組、中劑量組、大劑量組,培養基中分別添加50,100,150 μmol· L-1的小、中、大劑量的PFFE-A。

1.3顯微鏡觀察各組結腸癌的細胞形態 將對數生長期的HT29細胞接種在24孔板上,并調整細胞密度到每孔2×104個,細胞分組同“1.2節”,培養24 h后,通過IX71倒置顯微鏡觀察細胞的形態變化。

1.4EdU染色檢測各組結腸癌細胞的增殖能力 將對數生長期的HT29細胞接種在24孔板上,并調整細胞密度到每孔3×105個,細胞分組同“1.2節”,培養24 h后,嚴格在試劑盒的要求下進行染色、固定、封片,拍照,LAS AF Lite圖像處理軟件進行統計分析

1.5Transwell小室檢測各組細胞的侵襲能力 將對數生長期的HT29細胞接種在6孔板上,并調整細胞密度到每孔1×106個,細胞分組同“1.2節”,培養24 h后,PBS重懸,滴加至預先基質膠包被的Transwell小室上室中,培養24 h后,漂洗、固定、染色[10],顯微鏡下觀察各組細胞的侵襲數量。

1.6異種種植結腸癌裸鼠模型 調整對數生長期的HT29細胞至每孔2×106個,細胞分組同“1.2節”,待細胞生長密度達到1×107個·mL-1時,消化,制成單細胞懸液,將裸小鼠按隨機數字表法分為正常對照組、PFFE-A(小、中、大)劑量組,每組8只,將已備好的各組細胞懸液分別皮下注射到小鼠的后肢腹股溝處,在28 d后,將150 mg· kg-1的熒光素Promega腹腔注射到小鼠體內,10 min后連接IVIS Spectrum成像系統[11],數碼相機對小鼠原位腫瘤拍照,IVIS Spectrum成像系統記錄結腸癌病灶轉移灶的情況,處死小鼠并無菌剝離小鼠的瘤體組織,稱體質量。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測各組細胞中上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)相關基因的表達 調整對數生長期的HT29細胞至每孔2×105個,細胞分組同“1.2節”,漂洗,Trizol試劑提取細胞的總RNA,將RNA逆轉錄為DNA,PCR儀擴增,采用2-△△Ct來表示基因mRNA的相對表達量[12],以GAPDH作為參照,基因序列:GAPDH正義鏈:5′-AAGGTGGTGAAGCAGGCAT-3′,反義鏈:5′-GGTCCAGGGTTTCTTACTCCT -3′;E-鈣黏蛋白(E-cadherin)正義鏈:5′-AACGGGGACGAAGTGCTAAG-3′,反義鏈:5′-CCTCTGCAGGACCTTGATCTC-3′;神經型鈣粘附蛋白(N-cadherin)正義鏈:5′-TGGAGGCCACTATCCGAGAA-3′,反義鏈:5′-GAAGCGCTCAGGCATAAACC-3′。

1.8Western blotting檢測各組細胞中EMT相關蛋白和TGF-β1、p-Smad2/3的表達水平 調整對數生長期的HT29細胞至每孔2×106個,細胞分組同“1.2節”,收集細胞,裂解,離心,定量,取樣品40 μg進行電泳分離,轉膜后,封閉液中孵育,加入一抗(1：500),4 ℃孵育過夜,加入二抗(1：1 000),顯色[13],以GAPDH作為內參。

1.9功能挽救實驗 調整對數生長期的HT29細胞至每孔2×106個,分別以150 μmol·L-1的PFFE-A(PFFE-A組)、150 μmol·L-1的PFFE-A+20 ng· mL-1的TGF-β1信號激動劑(重組人TGF-β1激動劑組)干預,另設立正常對照組HT29細胞,不進行任何干預,分別進行Edu以及Transwell小室實驗,評估細胞的增殖與侵襲能力。

2 結果

2.1各組HT29細胞的形態改變 顯微鏡下正常對照組HT-29細胞形狀規整,多為圓形或橢圓形,細胞貼壁生長良好,胞間連接緊密,活性細胞呈片狀聚集生長;PFFE-A 小、中、大劑量組細胞的生長受限明顯,活性細胞數量明顯減少,細胞間的連接松散,成片生長的細胞體積明顯減小,并且隨藥物劑量的升高,可見的漂浮細胞或壞死細胞數量明顯增多,見圖1。

2.2EdU染色檢測各組結腸癌細胞的增殖能力 EdU染色結果顯示,與正常對照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細胞中的EdU陽性比例顯著下降(t=-4.536～-1.257,P<0.05),并且具有明顯的劑量依賴性(P<0.05),見圖2。

2.3Transwell小室檢測各組細胞的侵襲能力 Transwell小室侵襲結果顯示,與正常對照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細胞穿過Matrigel膠的細胞數量明顯下降(t=-78.426～-24.927,P<0.05),具有明顯的劑量依賴性(P<0.05),見圖3。

2.4各組結腸癌細胞體內生長與轉移的能力 異種種植結腸癌裸鼠模型結果顯示,與正常對照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細胞皮下成瘤瘤組織質量顯著下降(t=-10.549～-2.157,P<0.05),具有顯著的劑量依賴性(P<0.05),見圖4。IVIS Spectrum成像系統結果顯示,與正常對照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細胞病灶轉移比例顯著下降(t=-47.916～-8.073,P<0.05),具有顯著的劑量依賴性(P<0.05),見圖5。

A.正常對照組;B.PFFE-A小劑量組;C.PFFE-A中劑量組;D.PFFE-A大劑量組。①與正常對照組比較,t=-10.549～-2.157,P<0.05;②與PFFE-A小劑量組比較,t=-8.447～-1.943,P<0.05;③與PFFE-A中劑量組比較,t=-2.571,P<0.05。

A.正常對照組;B.PFFE-A小劑量組;C.PFFE-A中劑量組;D.PFFE-A大劑量組。①與正常對照組比較,t=-47.916～-8.073,P<0.05;②與PFFE-A小劑量組比較,t=-33.745～-6.877,P<0.05;③與PFFE-A中劑量組比較,t=-7.359,P<0.05。

A.正常對照組;B.PFFE-A小劑量組;C.PFFE-A中劑量組;D.PFFE-A大劑量組。①與正常對照組比較,t=-11.258～-3.018,-10.982～-2.847,P<0.05;②與PFFE-A小劑量組比較,t=-9.673～-2.542,-8.961～-1.846,P<0.05;③與PFFE-A中劑量組比較,t=-2.746,-1.445,P<0.05。

A.正常對照組;B.PFFE-A小劑量組;C.PFFE-A中劑量組;D.PFFE-A大劑量組。①與正常對照組比較,t=-4.687～-2.156,-5.743～-2.259,P<0.05;②與PFFE-A小劑量組比較,t=-3.872～-1.761,-4.975～-2.093,P<0.05;③與PFFE-A中劑量組比較,t=-2.147,-2.004,P<0.05。

2.5各組細胞中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達 RT-PCR結果和Western blotting檢測結果顯示,與正常對照組比較,PFFE-A小、中、大劑量組細胞中E-cadherin的mRNA和蛋白的表達顯著升高(t=-11.258～-3.018,P<0.05),N-cadherin的mRNA和蛋白的表達顯著降低(t=-10.982～-2.847,P<0.05),具有顯著的劑量依賴性(P<0.05),見圖6。

2.6Western blotting檢測各組細胞中TGF-β1、p-Smad2/3的表達水平 Western blotting檢測結果顯示,與正常組對照比較,PFFE-A小、中、大劑量組細胞中TGF-β1、p-Smad2/3的表達顯著下降(t=-4.687～-2.156,-5.743～-2.259,P<0.05),具有顯著的劑量依賴性(P<0.05),見圖7。

2.7功能挽救實驗結果 EdU以及Transwell小室實驗結果顯示,與正常對照組細胞比較,PFFE-A組細胞、重組人TGF-β1激動劑組細胞EdU陽性比例以及細胞侵襲數量明顯下降,與PFFE-A組細胞比較,重組人TGF-β1激動劑組細胞EdU陽性比例以及細胞侵襲數量明顯回升,差異均具有統計學意義(t=-62.958～-13.256,P<0.05),見圖8。

①與正常對照組比較,t=-62.958～-13.256,P<0.05;②與PFFE-A組比較,t=-44.571～-21.989,P<0.05。

3 討論

目前,大腸癌的發病率逐年升高,并且患者的5年生存率仍比較低[14]。已有的研究顯示[15]大腸癌患者在確診后的再次局部復發及發生靶器官的轉移性擴散,直接危及患者的生命安全。因此從疾病的分子機制出發,積極探索腫瘤的增殖以及轉移的分子標志物,開發新型的抗腫瘤藥物在臨床上有助于提高患者的生命質量。

海洋褐藻(昆布)作為我國傳統的藥食同源性的中藥組分,具有抗炎、抗病毒以及抗腫瘤效用,其中,海洋褐藻的抗腫瘤效應仍處于實驗探索階段[16]。MANANDHAR等[17]研究顯示PFFE-A作為海洋褐藻的重要的生物活性組分,展示了多種靶向效應,能明顯抑制肝癌細胞的增殖。本研究結果顯示,PFFE-A的應用能明顯抑制HT29細胞的體外的增殖與侵襲、體內的生長與轉移,并且這些效應顯示出良好的劑量依賴性。這些結果表明了藥物對疾病的良好的干預作用。

細胞的EMT是完成腫瘤細胞增殖、侵襲與轉移的關鍵步驟[18]。MOSA等[19]研究顯示EMT后,促使癌細胞在原發位點進行增殖,并直接推動其與原發腫瘤的分離,并浸潤到其他靶器官中。CORBET等[20]研究顯示抑制結腸癌細胞的EMT過程能明顯抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移能力。E-cadherin表達的缺失以及N-cadherin表達的增強是發生EMT的標志性事件。本研究的PCR與Western blotting結果均顯示PFFE-A能明顯抑制N-cadherin的表達,而增加E-cadherin的表達,從而抑制結腸癌細胞的EMT過程。

已有的研究數據顯示[21]腫瘤的增殖以及轉移過程是一個在多種信號(包括TGF-β1/Smads信號在內)共同作用的病理過程。研究顯示[22]TGF-β1被外界因子激活后,促使下游轉錄因子Smad2、Smad3發生磷酸化而生成p-Smad2/3,促使腫瘤信號入核,促進相關癌基因的轉錄以及翻譯,增強癌細胞的增殖與侵襲。KIM等[23]研究顯示,阻斷TGF-β1/Smads的傳導能顯著抑制結腸癌細胞的EMT過程,抑制腫瘤細胞的增殖與轉移。本研究結果顯示PFFE-A能顯著抑制TGF-β1的表達,抑制Smads(Smad2、Smad3)的磷酸化,并且具有明顯的劑量依賴性,挽救實驗結果顯示TGF-β1信號激動劑逆轉PFFE-A對大腸癌細胞增殖與侵襲的抑制。

綜合上述,PFFE-A能抑制腫瘤細胞的EMT過程,抑制大腸癌細胞HT29的體外增殖與侵襲能力,下調其體內生長與轉移的能力,這可能是通過下調TGF-β1/Smads信號實現的,但是PFFE-A在大腸癌中是否還存在其他作用靶點仍需更為深入的研究。