芒果苷通過調節miRNA-483-3p減輕良性前列腺增生腺體纖維化*

楊楚顥,陳鏡樓,陳濤

(1.江漢大學附屬醫院藥劑科,武漢 430014;2.江漢大學醫學部,武漢 430056;3.武漢市第一醫院藥學部,武漢 430014)

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia,BPH)是中老年男性的常見疾病,發病率隨年齡遞增。據報道,BPH在50歲以上男性群體中的發病率已經超過50%[1]。BPH和其帶來的下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms,LUTS)給患者帶來極大的生活障礙和持續性的經濟壓力。5α-還原酶抑制劑和α受體阻滯劑是BPH臨床干預的推薦藥物。然而,α受體阻滯劑并不能減小前列腺體積,而使用5α-還原酶抑制劑后25%～30%的患者LUTS沒有改善,甚至有5%～7%的患者出現進一步惡化[2]。隨著外科手術的改進,相對于經尿道電切除手術,銩激光前列腺切除術等正得到廣泛的應用,但依然存在23%以上概率的術后LUTS等問題[3]。研究發現BPH的3個主要病理生物學過程包括腺體增生、平滑肌收縮和前列腺纖維化,3個過程可以單獨或聯合作用,促進BPH的臨床進展[4]。BPH通常伴隨(盡管并非總是)LUTS,而以細胞外基質過度沉積為特點的纖維化將損傷前列腺尿道柔韌性,從而引起尿路梗阻癥狀[1,5]。目前針對器官纖維化的防治手段十分有限[6]。芒果苷是一種天然黃酮類化合物,具有抗菌、降低膽固醇、抗過敏、強心、抗糖尿病、抗腫瘤、神經保護、抗氧化和免疫調節等多種生物活性[7]。研究顯示,芒果苷對腎臟、肺、心臟和肝臟等器官纖維化具有改善作用[8]。筆者尚未見有關芒果苷對前列腺纖維化影響的報道。本文研究芒果苷對前列腺纖維化的影響和其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 特殊化學修飾的微小RNA(MicroRNA,miRNA)-483-3p 拮抗劑購于上海吉瑪生物有限公司(批號:12953)。丙酸睪酮注射液購于天津金耀藥業有限公司(批號:150822)。芒果苷購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(純度≥98%,批號:M14062)。非那雄胺片購于杭州默沙東制藥有限公司(批號:U011856,規格:每片5 mg)。熒光素酶報告試劑盒(批號:E2920)和psiCHECKTM-2 載體(批號:C8021)購于美國Promega公司。實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)檢測試劑盒購于美國KAPA Biosystems公司(批號:KM4101)。羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號:20190626)。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、絲裂原活化蛋白激酶2(mmitogen activated protein kinase 2,MK2)和絲裂原活化蛋白激酶6(mitogen-activated protein kinase kinase 6,MKK6)引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2實驗動物 7周齡無特定病原體(SPF)級雄性C57BL/6小鼠(體質量22～24 g)購于華中農業大學(動物生產許可證號:SCXK鄂2015-0019)。動物飼養于(23±2) ℃,濕度50±5%及12 h光照/12 h黑暗循環環境中。

1.3實驗設備 Stepone plus型實時定量PCR儀(美國ABI公司)。Luminoskan 5200110型熒光酶標儀(美國ThermoFisher公司)。

1.4實驗方法

1.4.1實驗動物分組與造模 實驗動物適應環境1周后,采用隨機數字表法分為5組(n=6):正常對照組、BPH模型對照組、非那雄胺組、芒果苷組和芒果苷+miRNA-483-3p拮抗劑組。小鼠BPH模型通過手術切除睪丸和每日皮下注射7.5 mg·kg-1丙酸睪酮建立,持續30 d[9]。其中非那雄胺組和芒果苷組分別每日灌胃給予1 mg·kg-1的非那雄胺(0.5% CMC-Na溶解)[9]或100 mg·kg-1的芒果苷[7]。芒果苷+miRNA-483-3p拮抗劑組每日灌胃給予100 mg·kg-1的芒果苷,并參考說明書每隔5 d進行1次尾靜脈注射10 mg·kg-1的miRNA-483-3p拮抗劑。正常對照組和BPH模型對照組小鼠每日灌胃給予等體積的0.5% CMC-Na。30 d后通過腹膜內注射80 mg·kg-1戊巴比妥鈉來麻醉小鼠,頸椎脫臼處死動物,分離前列腺,取部分組織制備石蠟切片行Masson和天狼猩紅染色,部分新鮮組織行qPCR、Western blotting和生化指標檢測。動物實驗操作遵從湖北省實驗動物管理條例,操作人員資格號TY20190784。

1.4.2前列腺纖維化評價 通過天狼猩紅和masson染色觀察前列腺膠原沉積情況,以及定量檢測前列腺組織Hyp含量綜合評價腺體纖維化程度。每張切片隨機選取3個視野,采用Image-Pro Plus 6.0版軟件計算染色陽性面積占比。前列腺Hyp含量按照試劑盒說明書步驟檢測。

1.4.3MK2信號通路評估 MK2信號通路的活躍程度一方面通過qPCR檢測前列腺MK2、TGF-β1和MKK6的mRNA水平評價。MK2(264 bp)前引物為5′-GGAAGTGCCTGCTGAT-3′,后引物為5′-AGTTGTGACTGGTGGTTT-3′。TGF-β1(153 bp)前引物為5′- AGGAGACGGAATACAGGG-3′,后引物為5′-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3′。MKK6(146 bp)前引物為5′-CCTCAGACCAGTTCCAC-3′,后引物為5′-CGCATCTTCTCCACCA-3′。根據試劑盒說明書行qPCR檢測。另一方面通過western blot檢測前列腺TGF-β1、MK2、p-MK2、MKK6和p-MKK6的蛋白水平評價。具體步驟參考前期研究基礎[10]。

1.4.4miRNA-483-3p水平檢測 miRNA-483-3p的前引物為5′- GGGTCACTCCTCCCCT-3′,后引物為5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′,逆轉錄RT引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAA-GACGGG-3′。參考說明書行qPCR檢測。

1.4.5熒光素酶報告測試 克隆MK2-3′UTR,并將其導入psiCHECKTM-2載體。分別構建MK2野生型(WT)和MK2突變型(MUT)的熒光素酶報告質粒。采用Lipofectamine3000將miRNA-483-3p共轉染入工具細胞HEK-293T,空白對照組轉染空白質粒。24 h后根據熒光素酶報告試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1芒果苷減輕前列腺纖維化 天狼猩紅和masson染色結果表明,與正常對照組比較,BPH模型對照組小鼠前列腺膠原沉積明顯(如箭頭所示,天狼猩紅染為紅色,Masson染為藍色),且膠原蛋白的主要成分Hyp的含量顯著性升高(P<0.01)。與BPH模型對照組比較,芒果苷組能夠有效抑制小鼠前列腺的膠原沉積,降低組織Hyp的含量(P<0.01)。與芒果苷組比較,miRNA-483-3p拮抗劑和芒果苷同時干預顯著加劇了前列腺膠原沉積,升高Hyp的含量(P<0.01)。結果表明,芒果苷具有減輕前列腺纖維化的潛力,且與調節前列腺miRNA-483-3p水平有關。見圖1。

A.正常對照組;B.BPH模型對照組;C.非那雄胺組;D.芒果苷組;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗組。①與BPH模型對照組比較,t(天狼猩紅)=0.262～12.09,t(masson)=1.753～16.229,t(Hyp)=3.045～13.593, P<0.01;②與芒果苷組比較,t(天狼猩紅)=-6.946,t(masson)=-5.762,t(Hyp)=-2.766,P<0.01。

2.2芒果苷抑制前列腺TGF-β1、MK2和MKK6水平 qPCR檢測結果(圖2)顯示,與正常對照組比較,BPH模型對照組小鼠前列腺TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平顯著性升高(P<0.01),而miRNA-483-3p的水平顯著性下降(P<0.01)。與BPH模型對照組比較,芒果苷組能夠顯著性升高前列腺miRNA-483-3p的水平,并降低TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平(P<0.01)。與芒果苷組比較,miRNA-483-3p拮抗劑組顯著升高了前列腺TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平(P<0.05),降低了miRNA-483-3p的水平(P<0.01)。

A.正常對照組;B.BPH模型對照組;C.非那雄胺組;D.芒果苷組;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗劑組。①與BPH模型對照組比較,t(miRNA-483-3p)=-4.377～12.321,t(MKK6)=1.609～15.75,t(MK2)=1.456～15.69,t(TGF-β1)=1.058～15.244,P<0.01;②與芒果苷組比較,t(miRNA-483-3p)=6.056,t(MK2)=-3.189,t(TGF-β1)=-3.854,P<0.01;③與芒果苷組比較,t(MKK6)=-2.284,P<0.05。

從圖3可以看出,與正常對照組比較,BPH模型對照組小鼠前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平顯著性升高(P<0.01)。與BPH模型對照組比較,芒果苷組能夠顯著性降低前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平(P<0.01)。與芒果苷組比較,miRNA-483-3p拮抗劑組顯著升高了前列腺前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平(P<0.01)。

A.正常對照組;B.BPH模型對照組;C.非那雄胺組;D.芒果苷組;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗劑組。①與BPH模型對照組比較,t(p-MKK6)=0.81～8.37,t(p-MK2)=0.444～7.376,t(TGF-β1)=0.738～10.833,P<0.01;②與芒果苷組比較,t(p-MKK6)=-6.029,t(p-MK2)=-5.399,t(TGF-β1)=-6.827,P<0.01。

2.3miRNA-483-3p靶向抑制MK2 通過生物信息學預測發現miRNA-483-3p與MK2存在結合位點。熒光素酶報告檢測結果顯示,相對于空白對照組,miRNA-483-3p模擬物共孵育能夠顯著抑制野生型MK2的熒光素酶活力(P<0.01),但對結合位點突變后的MK2無此效應,提示miRNA-483-3p具有靶向抑制MK2的能力。見圖4。

①與野生型(WT)空白對照比較,t=-15.202,P<0.01。

3 討論

器官纖維化是一種漸進性的病理過程,通常表現為細胞外基質(extracellular matrix,ECM))的異常積聚。其中,膠原沉積是重要特征之一,終點將是器官的進行性結構重塑[11-12]。最近研究報道和我們的前期研究發現均表明,阻斷纖維化是防治BPH和改善LUTS的可行方向[1,4,10]。現已知有多種信號通路參與器官纖維化的過程[11]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族在細胞增殖分化、血管生成、氧化應激等多種生理活動中發揮重要作用[13]。MK2是MAPK活化蛋白激酶,在多種病理條件下均已觀察到MK2的異常活躍現象[14]。此外,MAPK通路的另一重要組成成分MKK6在前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌等疾病中均呈過表達狀態[15]。不僅如此,MKK6是MK2的上游調控者,它們的異常表達將影響肌成纖維細胞的生物行為[16]。

TGF-β1是MK2的另一上游節點[17]。迄今為止,TGF-β1是已知的最強力的促纖維化因子之一,能夠直接介導肌成纖維細胞的增殖和分化,以及ECM的合成和分泌,從而加速器官纖維化的進程[18]。阻斷MK2能夠在一定程度上抑制TGF-β誘導的成纖維細胞分化和ECM蛋白分泌[17]。筆者前期研究發現,特異性阻斷MK2能夠明顯抑制人前列腺細胞的細胞增殖和膠原沉積[10]。本研究進一步證實,芒果苷改善前列腺膠原沉積和抑制腺體纖維化的能力與降低MK2信號通路活躍程度有關。

MiRNAs是一種內源性短鏈非編碼RNA,通過5'端與靶基因mRNA的3'端中非翻譯區特異性結合而抑制靶基因的功能[19]。近年來,miRNA-483家族基因參與多種疾病的發生發展從而引起越來越多的關注。然而有關其確切的生物效應和作用機制仍有待闡明。報道顯示[20],一方面miRNA-483在多種腫瘤中呈現高表達現象;另一方面,miR-483-3p具有抑制肝臟腫瘤和纖維化的潛力。筆者在本實驗觀察到良性前列腺增生組織中miR-483-3p的水平明顯下降。通過芒果苷干預升高小鼠前列腺miR-483-3p的水平能夠顯著性抑制前列腺的膠原沉積情況。并且,miR-483-3p特異性拮抗劑能夠很大程度抵消芒果苷的上述作用。進一步的生物信息學預測和熒光素酶報告驗證結果顯示,miR-483-3p能夠阻斷MK2表達。

綜上所述,本研究結果證實良性前列腺增生組織miRNA-483-3p的表達水平下降,芒果苷能夠通過調節miRNA-483-3p,抑制MK2表達來減輕前列腺纖維化。我國老年人群占比不斷上升,因此受前列腺纖維化相關的LUTS困擾的人群也逐年增加[21],本研究豐富了治療藥物的潛在來源。