大豆異黃酮對幼年小鼠生殖發(fā)育的影響 Δ

許文達，董思林，張 晗，宋迎琳，遲鏡儀，趙振軍，石 慧 （煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005）

大豆異黃酮（soybean isoflavones，SI）主要存在于豆科植物中，是通過苯丙醇途徑合成的一種具有較強生物活性的重要次生代謝物[1]。由于飲食結(jié)構(gòu)的差異，亞洲人群SI 攝入量明顯高于歐美人群[2]。研究表明，SI 對人體健康有積極作用，具有緩解骨質(zhì)疏松癥[3]、預防心血管疾病[4]、調(diào)節(jié)血脂[5]和抗氧化、抗炎、抗腫瘤、提高免疫[6]等活性，并可影響子宮內(nèi)膜細胞和顆粒細胞的增殖與凋亡[7]。

近年來，隨著“內(nèi)分泌干擾物”概念的引入，人們對激素有了進一步的認識[8]。SI作為一種激素類內(nèi)分泌干擾物，若長期、大劑量攝入是否會產(chǎn)生副作用，目前尚無定論。探索性研究發(fā)現(xiàn)，SI可能會破壞生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡，甚至影響機體的發(fā)育和生殖功能[9]。幼年期為生長發(fā)育的重要階段，是生殖功能發(fā)育和成熟的關(guān)鍵時期，容易受到內(nèi)外因素的影響。有研究指出，長期飼喂同為內(nèi)分泌干擾物的果糖可改變機體脂質(zhì)代謝和激素水平，進而影響生殖功能[10]；此外有研究證實，胎兒和新生兒期SI 暴露與小鼠成年后生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)[8]。因此，本研究擬觀察不同劑量SI 對幼年小鼠生殖發(fā)育的影響，旨在為其安全性評估提供實驗參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括820 型組織切片機（美國Reichert-Jung 公司）、Ti-S 型雙端口倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）、DM1000 LED 型生物光學顯微鏡（德國Leica公司）、SpectraMax iD3型多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、DHG-9140A型烘箱（上海一恒科學儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

SI 原料藥（批號C12916812，純度40%）購自上海麥克林生化科技有限公司；吐溫80（批號M25HS179460）和甘油（分析純）均購自上海源葉生物科技有限公司；Davidson’s 固定液（批號20140210）購自北京索萊寶科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號011623230614）、一步法TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（批號112822230321）均購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；睪酮檢測（干粉法）試劑盒（批號20230605）、雌二醇檢測（干粉法）試劑盒（批號20230605）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒（批號20220530）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號20220530）、微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號20220530）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒（批號20220530）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物

SPF級C57BL/6幼鼠30只（2周齡，體重8～10 g，雌雄各半），購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（魯）2019 0003。小鼠分籠飼養(yǎng)并自由進食、飲水，飼養(yǎng)條件為每12 h明暗交替、室溫16～25 ℃、相對濕度45%～60%。本研究實驗方案經(jīng)煙臺大學動物倫理委員會審查批準（編號YTU20210203-2）。

2 方法

2.1 分組與給藥

取幼鼠30 只，適應性喂養(yǎng)3 d 后隨機分為對照組（1%吐溫80溶液）和SI小、大劑量組（10、100 mg/kg），每組10只，雌雄各半。各組幼鼠雌雄分開飼養(yǎng)，以耳釘標號區(qū)分。對照組幼鼠灌胃1%吐溫80溶液，SI各劑量組幼鼠灌胃相應藥液（以1%吐溫80 溶液為溶劑，劑量參考相關(guān)文獻[11―12]設(shè)置），每天15：00灌胃1次，持續(xù)2周。

2.2 體重測定

于每天灌胃前及末次灌胃后稱定各組幼鼠體重，并按下式計算體重增長百分比：體重增長百分比＝（末次灌胃后幼鼠體重－首次灌胃前幼鼠體重）/首次灌胃前幼鼠體重×100%。

2.3 血清性激素水平測定

末次給藥后，幼鼠禁食不禁水3 h，于眼眶靜脈叢采血，血樣于室溫下靜置20 min 后，以3 000 r/min 離心15 min，取上層血清適量，嚴格按照相應試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測血清中雌二醇和睪酮水平。

2.4 生殖器官氧化應激指標檢測

取血后，各組幼鼠以頸椎脫臼法處死，分別分離雌性幼鼠的卵巢組織和雄性幼鼠的睪丸組織。取上述組織適量，稱重后加生理鹽水，制成10%勻漿液，以3 000 r/min 離心10 min，分離上清液，嚴格按照相應試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測上述組織勻漿中SOD、GSHPx活性，MDA含量和T-AOC。

2.5 生殖器官病理學觀察

取各組雌性幼鼠卵巢組織和雄性幼鼠睪丸、附睪組織適量，置于固定液中，于室溫下固定48 h 后，進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，經(jīng)HE染色后，使用光學顯微鏡觀察并隨機選取每張切片的6個視野拍照，記錄各組幼鼠上述組織的病理變化。

2.6 生殖器官細胞凋亡檢測

取“2.5”項下各組雌性幼鼠卵巢組織和雄性幼鼠睪丸、附睪組織的石蠟切片，脫蠟后滴加不含DNA酶的蛋白酶K（20 μg/mL）適量，于37 ℃下孵育15 min；以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次后，加TUNEL檢測液50 μL，于37 ℃下避光孵育1 h；以PBS清洗3次，用抗熒光淬滅封片液封片后使用熒光顯微鏡觀察。隨機選取每張切片的5個視野觀察并拍照，使用Image J軟件記錄視野內(nèi)的凋亡陽性細胞（呈綠色熒光）數(shù)量及細胞總數(shù)，并計算凋亡率：凋亡率＝凋亡陽性細胞數(shù)量/細胞總數(shù)×100%。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 幼鼠體重增長情況

雌性幼鼠的體重增長百分比有隨SI 劑量增大而逐漸升高的趨勢，其中SI 大劑量組顯著高于對照組（P＜0.05）；雄性幼鼠的體重增長百分比有隨SI 劑量增大而逐漸下降的趨勢，其中SI大劑量組顯著低于對照組（P＜0.01）。結(jié)果見圖1。

a：與對照組比較P＜0.05；b：與對照組比較P＜0.01。圖1 SI對幼鼠體重增長百分比的影響（±s，n＝5）

3.2 幼鼠血清中性激素水平

與對照組比較，SI各劑量組雌性幼鼠的血清睪酮水平和雄性幼鼠的血清睪酮、雌二醇水平均顯著升高（P＜0.05），而雌性幼鼠的血清雌二醇水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 SI 對幼鼠血清中性激素水平的影響（±s，n＝5，pg/mL）

表1 SI 對幼鼠血清中性激素水平的影響（±s，n＝5，pg/mL）

a：與對照組比較，P＜0.05。

組別對照組SI小劑量組SI大劑量組雌性幼鼠睪酮62.56±2.42 206.28±2.20a 204.71±1.56a雌二醇23.92±0.15 16.50±0.03a 16.20±0.41a雄性幼鼠睪酮216.87±2.08 669.19±5.61a 495.48±4.97a雌二醇13.83±0.09 15.70±0.15a 14.12±0.11a

3.3 幼鼠生殖器官組織中氧化應激指標水平

與對照組比較，SI 大劑量組雌性幼鼠卵巢組織中SOD 活性和SI 小、大劑量組雌性幼鼠卵巢組織中MDA含量均顯著降低，SI 小劑量組雌性幼鼠卵巢組織中GSH-Px 活性和SI 小、大劑量組雌性幼鼠卵巢組織中TAOC 均顯著升高（P＜0.01），而SI 各劑量組雄性幼鼠睪丸組織中上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2、表3。

表2 SI 對幼鼠卵巢組織中氧化應激指標水平的影響（±s，n＝5）

表2 SI 對幼鼠卵巢組織中氧化應激指標水平的影響（±s，n＝5）

a：與對照組比較，P＜0.01。

組別對照組SI小劑量組SI大劑量組SOD/（U/mg）11.11±1.00 13.32±17.11 2.79±1.43a GSH-Px/（U/mg）422.90±65.90 961.55±805.57a 453.37±147.96 T-AOC/（mmol/L）0.14±0.01 0.52±0.01a 0.53±0.01a MDA/（nmol/mg）10.12±6.23 1.63±1.16a 2.39±1.08a

表3 SI 對幼鼠睪丸組織中氧化應激指標水平的影響（±s，n＝5）

表3 SI 對幼鼠睪丸組織中氧化應激指標水平的影響（±s，n＝5）

組別對照組SI小劑量組SI大劑量組SOD/（U/mg）0.51±0.10 0.85±0.45 0.39±0.11 GSH-Px/（U/mg）151.52±38.34 81.38±36.26 42.83±13.62 T-AOC/（mmol/L）0.30±0.02 0.26±0.01 0.29±0.01 MDA/（nmol/mg）0.25±0.19 0.51±0.46 0.34±0.32

3.4 幼鼠生殖器官組織病理變化情況

對照組雌性幼鼠卵巢組織中可見多層立方顆粒細胞和內(nèi)含液體的竇卵泡；SI小劑量組雌性幼鼠卵巢組織中可見發(fā)育良好的囊性卵泡，并可見一層厚且有序、形狀完整的顆粒細胞，而SI 大劑量組囊性卵泡更大，卵泡膜向卵泡腔內(nèi)塌陷，出現(xiàn)明顯白體。結(jié)果見圖2。

黑色箭頭：竇卵泡；藍色箭頭：囊性卵泡；紅色箭頭：白體。圖2 SI 對雌性幼鼠卵巢組織病理形態(tài)影響的顯微圖（HE染色）

對照組雄性幼鼠睪丸組織中各級生精細胞和附睪組織中上皮細胞均排列緊密有序。SI小、大劑量組雄性幼鼠睪丸組織中部分生精細胞脫落，各級精母細胞排列較為松散；附睪組織中上皮細胞皺縮、排列松散，且部分上皮細胞脫落。結(jié)果見圖3、圖4。

黑色箭頭：精母細胞；藍色箭頭：支持細胞；紅色箭頭：長形精子。圖3 SI 對雄性幼鼠睪丸組織病理形態(tài)影響的顯微圖（HE染色）

黑色箭頭：脫落的上皮細胞團；紅色箭頭：尾部的上皮細胞。圖4 SI 對雄性幼鼠附睪組織病理形態(tài)影響的顯微圖（HE染色）

3.5 幼鼠生殖器官細胞凋亡情況

與對照組比較，SI各劑量組雌性幼鼠卵巢組織中凋亡陽性細胞有所減少，細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05）；而SI 各劑量組雄性幼鼠睪丸及附睪組織中凋亡陽性細胞均有所增加，細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖5、表4。

表4 SI對幼鼠生殖器官組織細胞凋亡率的影響（±s，n＝5，%）

表4 SI對幼鼠生殖器官組織細胞凋亡率的影響（±s，n＝5，%）

a：與對照組比較，P＜0.05。

組別對照組SI小劑量組SI大劑量組卵巢組織22.90±0.42 6.20±3.11a 5.92±1.81a睪丸組織3.06±0.28 14.40±9.44a 25.02±3.95a附睪組織15.50±14.85 67.10±27.01a 86.60±4.53a

圖5 SI 對幼鼠生殖器官組織細胞凋亡影響的顯微圖（TUNEL染色）

4 討論

SI對成年個體的有益作用已得到了初步證實，但隨著人們對內(nèi)分泌干擾物認識的不斷深入，作為內(nèi)分泌干擾物的SI 對幼年個體生殖發(fā)育是否絕對有益，仍值得探討。

本研究首先考察了SI 對幼鼠體重的影響，結(jié)果顯示，SI 對雌性幼鼠的體重增長有促進作用，但對雄性幼鼠的體重增長有抑制作用。隨后，本研究通過檢測幼鼠生殖器官組織細胞凋亡率、氧化應激指標和觀察其生殖器官組織病理改變情況發(fā)現(xiàn)，SI可顯著提高雌性幼鼠卵巢組織中GSH-Px活性（小劑量）和T-AOC（小、大劑量），并可顯著降低MDA 含量（小、大劑量）和細胞凋亡率（小、大劑量），提示該成分可提高雌性幼鼠卵巢組織的抗氧化應激能力，減輕卵巢組織的氧化應激損傷并減少細胞凋亡，可見SI對雌性幼鼠的卵巢組織具有一定的保護作用，與趙洪強等[13]的研究結(jié)果基本一致，即SI 具有保護卵巢的作用，可修復外界毒性物質(zhì)所導致的氧化應激損傷。需要注意的是，從病理觀察結(jié)果來看，SI 各劑量組雌性幼鼠卵巢組織均可見囊性卵泡，但是否會對其生殖發(fā)育產(chǎn)生影響，尚需進一步確認。同時，本研究結(jié)果顯示，SI對雄性幼鼠生殖器官的抗氧化應激能力并無明顯改善，且睪丸及附睪組織的細胞凋亡率均較對照組顯著升高，并伴有明顯的細胞脫落現(xiàn)象。SI屬于低毒性物質(zhì)，當短期內(nèi)少量攝入時，該成分可在10～14 h 內(nèi)被完全排出體外；同時，SI 具有蓄積毒性，即長期服用后，蓄積的SI 可能對機體各組織器官產(chǎn)生危害[14]。本研究結(jié)果初步顯示，持續(xù)2周攝入SI對雄性幼鼠睪丸及附睪組織具有一定的蓄積毒性。

為分析SI生殖毒性的產(chǎn)生原因，本研究還檢測了雌雄幼鼠的血清性激素水平。結(jié)果顯示，SI各劑量組雌性幼鼠血清睪酮水平均顯著升高，雌二醇水平均顯著降低；而SI 各劑量組雄性幼鼠血清睪酮、雌二醇水平均顯著升高，與王文祥等[15]的研究結(jié)果基本一致。筆者推測，SI對雌雄幼鼠生殖器官的不同影響可能與其對小鼠血清性激素水平的影響差異有關(guān)，但具體機制還有待于進一步探索。

綜上所述，SI可提高雌性幼鼠卵巢組織的抗氧化應激能力，減少其氧化應激損傷，但對雄性幼鼠的生殖器官具有一定的蓄積毒性。