UPLC-HRMS法同時直接測定白酒中多種痕量呈香呈味物質及衍生物含量

楊軍林，尹艷艷，尹延順，楊少娟，田棟偉，謝 丹，尤小龍，吳 成，胡建鋒，張德芹

（貴州習酒股份有限公司，貴州 遵義 564622）

白酒風味是決定其品質的重要因素，目前主要針對白酒中揮發性香氣物質的研究較多[1-3]。但白酒作為固態發酵蒸餾的產物，同樣存在某些非揮發性物質[4-5]。據文獻報道，非揮發性物質的存在對于白酒的風格特征同樣產生重要作用，它作為潛在的重要呈香呈味物質，構成了白酒口感的豐富性和復雜性；可與揮發性物質產生相互作用，調節揮發性物質的揮發性能，改變并協調白酒的香氣結構，如調節放香強度與香氣持久性；非揮發性物質還具有獨特和重要的生物活性功能和效果[4-7]。

有機酸類物質是白酒的重要風味物質，其中有機酸的種類和含量不僅影響白酒發酵過程微生物的生長與繁殖，也影響酯類香氣物質的合成。作為白酒中重要呈香呈味物質，起著呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用，其含量及組成直接影響著白酒的風味、品質及飲后舒適度[8-9]。在白酒生產中關注較多的是難揮發性有機酸，且以乳酸為主的比例及其量化關系研究較多，研究方法通常為氣相色譜或氣相色譜-質譜聯用技術[10-11]；同樣，其他難揮發性有機酸也不易氣化，并且即使進行酯化衍生處理，有些也無法被有效解析[12]。因此，現階段主要采用高效液相色譜法及離子色譜法進行白酒中難揮發性有機酸的定性定量分析。

白酒中氨基酸主要來源于釀酒原料中蛋白質酶降解、發酵過程中微生物的代謝及其發酵后微生物細胞自溶[13-14]。氨基酸對葡萄酒品質有重要影響[15]，它也是黃酒中重要的營養成分和風味前驅體[16-18]，同樣，白酒中氨基酸及其衍生物作為風味前體物質可能對其呈香呈味有重要影響[13]。其中，飲料酒中雜醇油主要是發酵過程中氨基酸脫氨基和脫羰基代謝產生，如正丙醇來自于蘇氨酸、異丁醇來自于纈氨酸、異戊醇來自于亮氨酸、2-苯乙醇來自于苯丙氨酸等。其次，在飲料酒發酵過程中氨基酸還與多種含氮化合物的形成相關，如吡嗪類化合物雜環氮原子來自α-氨基酸[19-20]。此外，白酒中生物胺與氨基酸也有一定聯系[21]，生物胺作為一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環類化合物，主要通過氨基酸的脫羧、醛與酮的胺化及轉氨基作用產生，對動植物和微生物活性細胞有重要的生理作用，適量生物胺有助于機體正常的生理功能，但過量會引起血壓升高、頭痛、皮疹等不良生理反應，有時則表現為胃腸功能紊亂，如出現嘔吐和腹瀉，并伴隨腹痛等癥狀[22-24]。此外，有研究表明白酒中吡咯烷約占總生物胺含量的50%以上，可能是其沸點接近白酒蒸餾溫度而進入酒體中造成的，并且吡咯烷是一種白酒中特有而其他酒類中沒有或含量很低的生物胺[25]。

目前，針對白酒中氨基酸多采用氨基酸自動分析儀以及柱前衍生-液相色譜儀檢測[26-27]，而對于白酒中難揮發性有機酸則主要通過高效液相色譜法及離子色譜法測定[28-30]，國內外研究人員開發了測定白酒中多種呈香呈味物質的檢測方法[4-5,8-9]，但針對白酒中多種痕量呈香呈味物質以及生物胺同時進行定性定量分析的檢測方法甚少。因此，本實驗通過超高效液相色譜-高分辨質譜儀建立一種同時測定白酒中多種痕量呈香呈味物質及衍生物含量的檢測方法，對白酒樣品中某些非揮發性物質進行準確定性定量分析，以期為后續推進白酒中的非揮發性物質組成及其量比關系對提高白酒品質研究提供數據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售白酒購于貴州遵義習水縣合力超市。

甲醇 德國Merck公司；甲酸 美國Thermo Fisher Scientific公司；15 種氨基酸混標（2.5 mmol/LL-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸以及1.25 mmol/LL-胱氨酸）和L-瓜氨酸（98.0%）德國Merck公司；2,3-二羥基丙酸（96.03%）上海麥克林生化科技有限公司；β-苯乙胺（98.6%）、酪胺（98.9%）、吡咯烷（98.5%）德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；L-色氨酸（99.04%）、色胺（98.4%）、L-酒石酸（99.2%）、L-蘋果酸（99.8%）、沒食子酸（99.1%）、阿魏酸（99.9%）、兒茶素（99.7%）、咖啡酸（99.4%）、木犀草素（98.6%）、綠原酸（99.4%）、對香豆酸（99.9%）、檸檬酸（98.9%）標準品 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；QT-1旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；HC-3518高速離心機 安徽中科中佳科學儀器公司；Raykol AUTO EVA氮吹儀 睿科集團（廈門）股份有限公司；AR2140萬分之一分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；艾科普超純水機美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確量取適量樣品于離心管中，經10 000 r/min高速離心10 min后直接過0.22 μm水系PES針筒式過濾膜于2.0 mL液相色譜進樣小瓶中，待上機分析。

1.3.2 超高效液相色譜分析

超高效液相色譜儀條件：選用Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱；采用0.1%甲酸溶液（A）和甲醇（B）為流動相，按表1程序梯度洗脫；柱溫為40 ℃，進樣量為2 μL，流速0.2 mL/min，分析時間為16 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

高分辨質譜儀離子源條件：加熱電噴霧電離源；鞘氣流量：40 arb；輔助氣流量：10 arb；噴霧電壓：±3.2 kV；離子源溫度：350 ℃；毛細管溫度：320 ℃。

高分辨質譜儀掃描條件：采用全掃描/數據依賴性二級掃描的正負離子同時掃描采集模式；一級掃描范圍為m/z50.0～400.0；一級掃描分辨率70 000；自動增益控制進入軌道阱中的離子數（AGC target）為106；最大注入時間30 ms；二級掃描分辨率：17 500；AGC target為5×104；最大注入時間50 ms；歸一化碰撞能量：10、20、30 eV。

各待測組分化合物信息及高分辨質譜參數見表2，采用外標法定量，儀器采集數據的定性定量分析采用Xcalibur 4.1軟件。

表2 各待測組分化合物信息及高分辨質譜參數Table 2 Information about and HRMS parameters for all analytes

1.3.3 待測組分標準溶液配制

各待測組分標準儲備液配制：將17 種氨基酸、4 種生物胺以及11 種難揮發性有機酸待測組分按照類別分別用超純水配制成濃度為100 μmol/L（L-胱氨酸為50 μmol/L）、5.0 μg/mL和10.0 μg/mL的混合標準儲備液，貯存于4 ℃備用；

待測組分混合標準工作系列溶液配制：以超純水為試劑，配制成不同濃度氨基酸系列標準溶液（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μmol/L）、不同質量濃度生物胺系列標準溶液（2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L）以及不同質量濃度難揮發性有機酸系列標準溶液（10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/L）。

1.4 數據處理與分析

用Xcalibur 4.1軟件處理數據，以待測組分標準工作溶液系列濃度為橫坐標（X），相應待測組分色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，擬合得到相關線性回歸方程；將白酒樣品經上述前處理之后通過超高效液相色譜-高分辨質譜儀分析，利用待測組分標準工作曲線計算，即得到白酒樣品中各待測組分的含量。每個實驗指標至少重復3 次。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

采用直接高速離心后過膜與經氮吹除乙醇后上機分析的兩種前處理方式，測定白酒中的木犀草素、β-苯乙胺和L-蘇氨酸，從而明確適用于分析白酒樣品中多組分的前處理方法。如圖1A所示，與先氮吹除乙醇的前處理方式相比，直接經高速離心膜過濾處理后的木犀草素色譜峰響應值明顯較高；同時，經添加木犀草素標準溶液的氮吹除乙醇樣品中其色譜峰響應值低于未添加標準溶液樣品，結果表明，氮吹除乙醇前處理方式不利于白酒樣品中木犀草素含量的測定，對檢測結果有不利影響；如圖1B所示，兩種前處理方式對添加標準溶液樣品中β-苯乙胺的色譜峰響應值影響差異不明顯；如圖1C所示，4 種樣品中L-蘇氨酸色譜峰響應值差異不明顯。因此，通過不采用氮吹除乙醇消除乙醇的干擾，僅采取高速離心后過膜處理即可實現白酒樣品中多種待測組分的檢測。

圖1 氮吹除乙醇樣品與直接離心后過膜樣品處理方式下待測組分色譜圖Fig.1 Chromatographic profiles of analytes in samples subjected to nitrogen blowing for ethanol removal or direct centrifugation and membrane filtration

2.2 儀器參數的優化

2.2.1 色譜柱對檢測結果的影響

本實驗考察了Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）3 種液相色譜柱對白酒樣品中32 種待測組分的分離效果影響，結果如圖2所示。以檸檬酸為例，樣品經前處理后上機分析發現Hypersil Gold C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）與Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）色譜柱分離檸檬酸色譜峰寬度較大，且出現了明顯的拖尾現象；但經Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱分離檸檬酸的色譜峰明顯優于其他2 種色譜柱。因此，采用Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱作為分析色譜柱，可實現白酒樣品中多組分的檢測。

圖2 不同液相色譜柱下待測組分色譜圖Fig.2 Chromatographic profiles of analytes in samples separatedon different liquid chromatographic columns

2.2.2 流動相洗脫體系對檢測結果的影響

考察了0.1%甲酸-甲醇、1 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）-甲醇兩種流動相洗脫體系對測定32 種待測組分的分離效果影響。如圖3所示，以吡咯烷為例，0.1%甲酸-甲醇流動相洗脫體系的吡咯烷色譜峰響應值明顯高于1 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）-甲醇流動相洗脫體系。因此，采用0.1%甲酸-甲醇流動相洗脫體系可以較好實現白酒樣品中32 種組分的分離。

圖3 不同流動相洗脫下待測組分色譜圖Fig.3 Chromatographic profiles of analytes in samples separated using different mobile phases

2.2.3 梯度洗脫程序對待測組分分離的影響

采用表3不同梯度洗脫程序參數考察不同梯度洗脫程序下待測組分分離情況。如圖4所示，以吡咯烷為例，洗脫程序1的吡咯烷色譜峰響應值明顯高于洗脫程序2，同時，洗脫程序3的吡咯烷色譜峰保留時間早于洗脫程序1，表明吡咯烷在洗脫程序3下尚未完全保留于液相色譜柱內而被流動相洗脫。因此，采用梯度洗脫程序1可以較好實現白酒樣品中32 種組分的分離。

圖4 不同流動相洗脫程序條件下待測組分吡咯烷的色譜對比Fig.4 Chromatographic profiles of pyrrolidine under different mobile phase elution procedures

表3 不同梯度洗脫程序參數Table 3 Parameters of different gradient elution procedures

2.2.4 分子離子峰對待測組分分析的影響

考察了2 種分子離子峰（[M＋H]＋和[M＋H]-形式）對待測組分分析的影響，白酒樣品經高速離心后過膜處理，再利用超高效液相色譜-高分辨質譜儀進行分析。通過不同待測組分的分子離子峰響應值得出，17 種氨基酸和4 種生物胺的分子離子峰在[M＋H]＋形式下響應值最高，11 種難揮發性有機酸的分子離子峰在[M＋H]-形式下響應值最高（圖5），各待測組分化合物信息及高分辨質譜參數詳見表2。

圖5 32 種待測組分的分子離子提取色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of 32 analytes in samples

2.3 各待測組分檢測方法的線性范圍和檢出限（limit of detection，LOD）及定量限（limit of quantitation，LOQ）

各待測組分混合標準工作系列溶液在上述條件下進行測定，采用外標法定量。以各待測組分的濃度為橫坐標（X）、定量離子的色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，即得相關線性回歸方程；以信噪比為3計算得到各待測組分的LOD，以信噪比為10計算得到LOQ。如表4所示，待測組分標準標準曲線的線性關系良好（R2＞0.990），且各待測組分的LOD、LOQ相對較低，可滿足后續白酒中待測組分的定量分析以及低含量組分的測定。

表4 各待測組分標準工作系列溶液的線性方程、LOD和LOQTable 4 Linear equations,detection limits and quantification limits of all analytes

2.4 各待測組分測定方法的回收率和精密度

在基質樣品中根據各待測組分的LOQ，加入3 個不同濃度的待測組分標準溶液，使其配制成加標樣品，按上述方法進行前處理，利用超高效液相色譜-高分辨質譜儀進行分析，每個加標水平做3 次平行，每個平行重復測定6 次，計算平均回收率，以驗證測定方法的準確度、精密度及穩定性，分析結果見表5。對于3 種不同的加標水平，其平均回收率在71.92%～117.45%范圍內，且相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在0.46%～5.48%之間。可見，該測定方法對白酒樣品中多種痕量呈香呈味物質及其衍生物具有良好的回收率、精密度及穩定性，同時，前處理方法對樣品中各待測組分損失較低。

表5 各待測組分測定方法的回收率和精密度Table 5 Recoveries and precision for all analytes

3 討論與結論

檢測白酒樣品中多組分的方法中，大多數會采取氮吹或者其他方式去除乙醇對檢測結果的干擾，達到更好的檢測效果[31]，但本研究發現對白酒樣品的前處理方法有氮吹或者其他方式除乙醇步驟，這會對白酒樣品中的痕量呈香呈味物質檢測造成不同程度的影響，而當不進行氮吹或者其他方式除乙醇，直接對白酒樣品進行高速離心、膜過濾時，卻可以更好地實現白酒樣品中多種痕量呈香呈味物質的檢測分析。同時，采用該方法可實現定性定量分析白酒樣品中多種痕量呈香呈味物質，進而結合滋味稀釋技術的分析方法，準確且高效地鑒定出白酒樣品中關鍵性呈香呈味物質[8,12]，這為進一步解析不同類型白酒樣品的風味成分構成提供了數據支撐。

本方法前處理過程簡單易操作，無需除去樣品中多余乙醇含量，也不用使用有機溶劑進行液液萃取處理，樣品僅需高速離心后過濾上機分析，同時，儀器分析過程僅需16 min便可完成一個白酒樣品中待測組分的含量測定，故前處理實驗成本低且低毒環保。該測定方法針對待測多組分化合物的線性關系良好，即R2＞0.990；同時各組分化合物LOQ低，即可滿足實際白酒樣品的相關化合物分析需求。其次，該方法準確性高和檢測能力強，通過采用高靈敏度、高分辨率和強抗干擾能力的超高效液相色譜-高分辨質譜儀可對白酒中多種痕量呈香呈味物質及衍生物精確定量。該方法適合任何白酒樣品中待測組分的定性定量分析，且樣品實驗用量少和分析時間短，可有效實現白酒中多種痕量呈香呈味物質的定性定量解析，能更好詮釋其對白酒香氣形成的貢獻情況。