豬圓環(huán)病毒2型疫苗抗原定量方法及其應(yīng)用

文｜何召慶* 徐晨 汪愛芬 尹秀鳳 南祥祝 邵營格 晁錦［兆豐華生物科技（南京）有限公司］

豬圓環(huán)病毒病是一種可以給豬場造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的疾病，當(dāng)前，豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）感染在很多豬場仍有很高的比例，給豬場管理帶來了巨大壓力。有效的疫苗免疫有利于豬抵抗病毒，減少病毒血癥的發(fā)生和縮短帶毒時間，因此，疫苗免疫仍是豬場控制PCV2的重要手段。

疫苗質(zhì)量是有效防控豬圓環(huán)病毒2型的關(guān)鍵。目前，我國已批準(zhǔn)上市的PCV2單苗和圓環(huán)病毒與支原體二聯(lián)滅活疫苗（簡稱圓支二聯(lián)滅活疫苗）共20種左右，生產(chǎn)企業(yè)數(shù)量多達(dá)60個左右，不同類型PCV2疫苗檢驗(yàn)方法差異較大，這些疫苗產(chǎn)品沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有的疫苗采用免疫攻毒試驗(yàn)法進(jìn)行效力檢驗(yàn)，有的疫苗通過抗體檢測法進(jìn)行效力檢驗(yàn)，還有的疫苗通過雙抗夾心ELISA進(jìn)行抗原含量檢測和相對效力法進(jìn)行檢驗(yàn)。免疫攻毒法和抗體檢測法需要用到試驗(yàn)動物，操作煩瑣，耗時耗力，重復(fù)性差，而雙抗夾心ELISA蛋白定量法存在誤差較大和毒株差異性等問題。不適合一般實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖企業(yè)對多種不同來源的PCV2疫苗抗原含量的檢測比較。

臨床上如何選擇質(zhì)量更好的疫苗是養(yǎng)殖企業(yè)面臨的難題。雖然疫苗佐劑、制備工藝等均可影響產(chǎn)品質(zhì)量，但對于PCV2全病毒滅活疫苗或其Cap蛋白亞單位疫苗而言，抗原精準(zhǔn)定量檢測對評價疫苗質(zhì)量非常重要。抗原含量是評估疫苗質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，直接影響疫苗的接種效果。

國內(nèi)商品化的PCV2疫苗有4類，包括全病毒滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗（有真核表達(dá)和原核表達(dá)之分）、嵌合病毒滅活疫苗和合成肽疫苗。這些疫苗中的圓環(huán)病毒抗原有的是全病毒，有的是Cap蛋白，實(shí)際上也不能排除既有全病毒也有Cap蛋白的可能性。

近十多年來，利用超速離心配合高效液相色譜技術(shù)，我國口蹄疫疫苗146S含量檢測方法在疫苗生產(chǎn)企業(yè)和集團(tuán)化養(yǎng)豬企業(yè)中得到應(yīng)用，極大促進(jìn)了口蹄疫疫苗的質(zhì)量控制。中國科學(xué)院基于高效體積排阻色譜（HPSEC）偶聯(lián)多角度激光散射儀（MALLS），建立了PCV2滅活疫苗及病毒樣顆粒疫苗抗原含量檢測方法。但該方法對儀器設(shè)備的要求較高，一般實(shí)驗(yàn)室不容易實(shí)現(xiàn)日常檢測。

借鑒上述技術(shù)要點(diǎn)，為了建立費(fèi)用低、速度快且能精準(zhǔn)定量PCV2相關(guān)疫苗有效抗原含量的方法，幫助養(yǎng)殖企業(yè)篩選優(yōu)質(zhì)疫苗。本研究采用普通的離子交換層析技術(shù)，通過篩選試驗(yàn)材料，通過多次試驗(yàn)、不同方法對各種樣品進(jìn)行驗(yàn)證，最終建立了一套可快速、精準(zhǔn)定量各種PCV2相關(guān)疫苗全病毒及其Cap蛋白抗原含量的方法，且成本更低，適合在規(guī)模化豬場推廣使用。

一、試驗(yàn)材料

1.主要儀器與設(shè)備。蛋白純化儀，AKTA。微量分光光度計(jì)，Thermo scientific公司。

2.主要試劑。層析填料，蘇州藍(lán)曉生物科技有限公司。

3.試驗(yàn)樣品種類與編號。PCV2全病毒細(xì)胞培養(yǎng)液（A）；PCV2 Cap蛋白真核表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)液（B）；PCV2 Cap蛋白原核表達(dá)細(xì)菌培養(yǎng)液（C）；油佐劑PCV2滅活疫苗（D）；水佐劑PCV2滅活疫苗或者水佐劑圓支二聯(lián)滅活疫苗（E）。

二、試驗(yàn)方法

1.試驗(yàn)樣品處置。

（1）PCV2全病毒細(xì)胞培養(yǎng)液處置。取PCV2全病毒細(xì)胞培養(yǎng)液1.5毫升至Eppendorf管中，反復(fù)凍融3次，12000轉(zhuǎn)/分，4℃高速離心3分鐘，取1毫升上清備用。共試驗(yàn)3批細(xì)胞培養(yǎng)液，分別標(biāo)記為A1、A2和A3。

（2）PCV2 Cap蛋白真核表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)液處置。取表達(dá)PCV2 Cap蛋白的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液1.5毫升至Eppendorf管中，反復(fù)凍融3次，12000轉(zhuǎn)/分，4℃高速離心3分鐘，取1毫升上清備用。共試驗(yàn)3批細(xì)胞培養(yǎng)液，分別標(biāo)記為B1、B2和B3。

（3）PCV2 Cap蛋白原核表達(dá)細(xì)菌培養(yǎng)液處置。取可溶性表達(dá)PCV2 Cap蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)液1.5毫升，離心獲得菌體，用15毫升PBS重懸菌體作10倍稀釋，菌體經(jīng)超聲破碎，12000轉(zhuǎn)/分，4℃高速離心3分鐘，取1毫升上清備用。共試驗(yàn)三批細(xì)菌培養(yǎng)液，分別標(biāo)記為C1、C2和C3。

（4）油佐劑PCV2滅活疫苗處置。取油佐劑PCV2滅活疫苗700微升，按1∶1體積比加入700微升三氯甲烷，振蕩混勻，12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心6分鐘，用移液器取出所有上層水相液體，計(jì)算水相體積/疫苗體積，計(jì)為R1。取200微升備用。共試驗(yàn)兩家企業(yè)的油佐劑PCV2疫苗共4批。分別標(biāo)記為D1、D2、D3和D4。

（5）水佐劑PCV2相關(guān)疫苗處置。取700微升水佐劑PCV2疫苗，按1∶1體積比加入700微升三氯甲烷，振蕩混勻，12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心3分鐘，用移液器取出所有上層水相液體，計(jì)算水相體積/疫苗體積，計(jì)為R1。取200微升備用。其中三家企業(yè)的水佐劑PCV2相關(guān)疫苗共3批，分別標(biāo)記為E1、E2和E3。

2.PCV2全病毒或Cap蛋白層析純化。將200微升按（1）～（3）方法處置的試驗(yàn)樣品，用PBS稀釋至5毫升，利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)按照已經(jīng)建立的PCV2全病毒/Cap蛋白層析純化標(biāo)準(zhǔn)操作程序，進(jìn)行離子交換層析純化。收集起峰段樣品，稀釋至5毫升。

采用SDS-PAGE結(jié)合灰度分析測定樣品純化前后PCV2全病毒或Cap蛋白純度。利用BCA法和分光光度法測定樣品純化前后總蛋白濃度。計(jì)算PCV2全病毒或Cap蛋白回收率。

3.建立PCV2全病毒或Cap蛋白含量檢測方法及計(jì)算公式。根據(jù)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果進(jìn)行分析，建立PCV2全病毒或Cap蛋白含量檢測流程，具體如下。

（1）樣品處置。

（2）離子交換層析純化。

（3）分光光度法測定總蛋白含量。

（4）計(jì)算原始樣品中的PCV2全病毒或Cap蛋白含量。

具體計(jì)算公式如下：

其中，C（s）為待檢樣品中PCV2全病毒或Cap蛋白含量（微克/毫升）；C（t）為分光光度計(jì)測定的稀釋后起峰段樣品中總蛋白含量（微克/毫升）；P為純度，在本公式中取常數(shù)0.65；R1為待檢樣品的水相占比；R2為回收率，在本公式中取常數(shù)0.82。

三、方法應(yīng)用

對待檢疫苗樣品分別用（4）～（5）方法進(jìn)行前處置，按照已建立的層析-分光光度法進(jìn)行PCV2抗原含量檢測，并通過已建立的PCV2抗原含量計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算。

四、結(jié)果與討論

3種不同來源的抗原，經(jīng)過前期處理和層析純化，通過SDS-PAGE結(jié)合灰度分析法可測定樣品純化前后PCV2全病毒或Cap蛋白純度。通過BCA法和分光光度法測定樣品純化前后總蛋白濃度，可以計(jì)算得到每次純化檢測的回收率。結(jié)果見表1、表2和表3。

表1 PCV2全病毒細(xì)胞培養(yǎng)液層析前、后回收率

表2 PCV2 Cap蛋白真核表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)液層析前、后回收率

表3 PCV2 Cap蛋白原核表達(dá)細(xì)菌培養(yǎng)液層析前、后回收率

用所建立的方法檢測了4種油佐劑PCV2滅活疫苗抗原含量，結(jié)果見表4。

表4 油佐劑PCV2滅活疫苗抗原含量檢測結(jié)果

用所建立的方法檢測了3種水佐劑PCV2滅活疫苗抗原含量，結(jié)果見表5。

表5 水佐劑PCV2滅活疫苗抗原含量檢測結(jié)果

本研究是在前期多次預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，經(jīng)過多次篩選，最終確定了一種適合圓環(huán)病毒2型及其Cap蛋白純化的層析填料，包括洗脫液濃度、時間等過程參數(shù)的確定，使其回收率和純度非常穩(wěn)定。需要說明的是，本研究確定的計(jì)算公式僅限于按照確定的材料和設(shè)備進(jìn)行操作，并非可以任意更換試驗(yàn)材料和設(shè)備后還適用。

毫無疑問，由于層析純化過程不可避免地存在回收率差異，該方法也一定會存在誤差，但與雙抗夾心ELISA法和免疫層析法等免疫學(xué)定量方法相比，從原理上決定了本研究建立的方法誤差范圍會小于上述兩種方法。比較適合臨床評價豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疫苗質(zhì)量。從臨床檢測圓環(huán)病毒2型相關(guān)疫苗抗原的結(jié)果看，不同廠家的產(chǎn)品確實(shí)存在較大差異。

該方法不適用于PCV2合成肽疫苗抗原的定量檢測。