丹參SmWRKY33基因的克隆與表達(dá)分析

龔婷 劉靈娣 溫春秀 武玉翠 王升 萬修福 孫亞倩 姜濤

摘要：為了研究WRKY33基因在丹參非生物脅迫中的作用機制，以白花丹參為試驗材料，對丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘出丹參WRKY33基因參考序列并設(shè)計特異性引物，利用基因克隆技術(shù)從丹參中克隆出WRKY33基因的全長cDNA，命名為SmWRKY33。對SmWRKY33基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時利用熒光定量方法探究SmWRKY33基因在逆境脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，SmWRKY33基因核苷酸長度為1 635 bp，編碼544個氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，SmWRKY33基因的理論相對分子量為60 835.66，等電點為7.00，定位于細(xì)胞核，不存在跨膜區(qū)及信號肽，SmWRKY33蛋白為不穩(wěn)定親水蛋白。親緣關(guān)系顯示，SmWRKY33與紫蘇、芝麻、白花泡桐的WRKY33親緣關(guān)系較近。密碼子偏好性分析得出擬南芥真核表達(dá)最適應(yīng)丹參SmWRKY33基因的外源表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果表明，SmWRKY33基因在低溫、高溫、PEG、NaCl等逆境脅迫誘導(dǎo)下具有不同的表達(dá)模式，其中低溫、NaCl能顯著誘導(dǎo)SmWRKY33基因的高表達(dá)，說明該基因?qū)囟日{(diào)節(jié)、鹽脅迫較為敏感，猜測其參與溫度、鹽脅迫調(diào)控反應(yīng)機制。本試驗首次從丹參中克隆出SmWRKY33基因，探討了該基因在丹參逆境脅迫下的作用機制，旨在為培育丹參的抗逆新品種提供參考基因。

關(guān)鍵詞：丹參；SmWRKY33基因；生物信息學(xué)；qRT-PCR；基因克隆

中圖分類號：S567.5+30.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0053-08

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科、鼠尾草屬多年生直立草本植物，是我國的大宗藥材之一［1］。2020版《中華人民共和國藥典》中記載：丹參以干燥根莖入藥，具有活血、止痛、生新等功效，用于治療胸痹心痛、月經(jīng)不調(diào)、衰弱失眠等病癥，臨床上常用于心血管疾病的治療［2］。丹參發(fā)揮藥效的成分主要有2類，其中包括丹酚酸類、丹參酮類化合物［3］。此外，丹參基因組完善，生育期短，成為研究中藥材在環(huán)境脅迫下的模型植物［4］。近些年來，丹參市場不斷擴大，野生丹參遠(yuǎn)不能滿足市場的需求；而在人工種植過程中，干旱會極大影響丹參的生長和品質(zhì)。劉大會等通過研究不同土壤和水分對丹參植株的影響，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重干旱和過多水分會導(dǎo)致丹參酮、丹酚酸B的含量與累積量明顯下降，進(jìn)而影響丹參的產(chǎn)量和品質(zhì)［5］。如何提高丹參的抗旱性和耐鹽性，培育丹參抗逆品種，成為一個熱門研究話題。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）的一個大家庭，參與了植物的生長發(fā)育、防御調(diào)控、逆境反應(yīng)等多種生物學(xué)過程，并在其中起著積極或消極的調(diào)節(jié)作用［6］。WRKYs通常由2個結(jié)構(gòu)組成，包括高度保守的WRKYGQK七肽結(jié)構(gòu)域（位于其N端的WRKY結(jié)構(gòu)域）和C端的鋅指基序［7］。WRKY結(jié)構(gòu)域能和順式作用元件W-box（C/T）TGAC（C/T）以及RAV1A、WLS元件特異性結(jié)合，說明它們具有不同的結(jié)合方式，并參與下游目的基因調(diào)控［8］。Yu等從小麥克隆出TaWRKY1-2D基因，研究表明TaWRKY1-2D蛋白可能參與小麥中植物激素生物合成、轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控、代謝途徑、蛋白激酶信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)以影響小麥生長機制，表明TaWRKY1-2D基因可以提高小麥的耐旱性［9］。Cai等從玉米中克隆出ZmWRKY17基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZmWRKY17在擬南芥中通過抑制一些ABA和逆境反應(yīng)基因的表達(dá)，提高對鹽脅迫的敏感性，降低對ABA的敏感性，以此來提高植物的耐鹽性［10］。Xiang等以擬南芥為模式植物，從中克隆出MFWRKY70基因，研究發(fā)現(xiàn)MFWRKY70基因定位于細(xì)胞核，通過該基因促進(jìn)根系生長和保水，極大提高根系對干旱、滲透、鹽脅迫的耐受性，以及在應(yīng)激條件下增強抗氧化酶系統(tǒng)和維持活性氧（ROS）穩(wěn)態(tài)和膜脂穩(wěn)定性［11］。目前丹參的WRKY33基因還未被研究發(fā)現(xiàn)，本研究首次從丹參中克隆出WRKY33基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時利用qRT-PCR對特異性表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究丹參調(diào)控次生代謝產(chǎn)物生物合成及逆境響應(yīng)的分子機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為丹參幼苗，品種為白花丹參，來自河北省農(nóng)林科學(xué)院（114.45°E，38.06°N），于2022年12月采樣進(jìn)行后續(xù)試驗。取丹參葉片，清水洗凈后液氮速凍，用于丹參RNA的提取。

RNA提取試劑盒TransZol Up Plus RNA Kit、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal、高保真酶試劑盒2×TranStart FastPfu、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、熒光定量試劑盒等，購自天北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD19-T載體、2×Taq Plus Master Mix，購自北京白鯊生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成

依照全式金高純度RNA植物提取試劑盒（目錄號：ER501-01）說明書，提取丹參葉片的總RNA；以丹參總RNA為模板，依照全式金TransScript One-Step Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（目錄號：AT311-03）說明書反轉(zhuǎn)錄體系，對丹參進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.2 丹參引物合成

根據(jù)丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用Primer 5.0軟件設(shè)計SmWRKY33基因特異性引物。上游引物：SmWRKY33-F 5′-ATGGCTTCTTCTAGCGGAAGC-3′；下游引物：SmWRKY33-R 5′-TCAGCTGAGGAAAGAGTCGAA-3′，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.3 丹參SmWRKY33基因克隆

以丹參cDNA為模板，參照全式金生物有限公司高保真DNA聚合酶2×TranStart FastPfu試劑盒方法擴增SmWRKY33基因全長。25 μL擴增體系如下：12.5 μL 2×Taq Plus MasterMix，1.0 μL SmWRKY33-F，1.0 μL SmWRKY33-R，1.0 μL Template cDNA，9.5 μL ddH2O。PCR擴增程序如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；16 ℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳監(jiān)測，用紫外成像儀進(jìn)行觀察，全式金膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與表達(dá)載體pMD19-T和大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化連接，挑取單克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 丹參SmWRKY33基因生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/），ExPASy-ProScale（https：//web.expasy.org/protscale/）對分子量、等電點等理化性質(zhì)和親疏水性進(jìn)行分析，利用Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線分析保守結(jié)構(gòu)域，利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM/）對序列信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）、NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線分析磷酸化、糖基化位點，利用PSORT Prediction（http：//psortl .hgc.jp/form.html）對基因SmDREB2A的cDNA編碼氨基酸序列亞細(xì)胞進(jìn)行定位，利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）對SmWRKY33蛋白進(jìn)行二、三級結(jié)構(gòu)等預(yù)測；利用CodonW、EMBOSS軟件分析丹參SmWRKY33基因密碼子的偏好性。

1.2.5 丹參SmWRKY33基因表達(dá)分析

對丹參根進(jìn)行低溫、高溫、PEG、NaCl處理，使用熒光定量分析SmWRKY33相對表達(dá)量，以丹參肌動蛋白基因Actin為內(nèi)參基因，利用軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計（表1）。

參照全式金PerfectStart Green qPCR SuperMix試劑盒中說明書進(jìn)行操作，20 μL反應(yīng)體系如下：10 μL PerfectStart Green qPCR SuperMix，0.4 μL引物-F（正向引物），0.4 μL 引物-R（反向引物），2.0 μL cDNA （1 ng），7.2 μL ddH2O。擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；4 ℃ 保存。每個反應(yīng)重復(fù)3次，使用2-ΔΔCT 法分析丹參SmWRKY33基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參SmWRKY33基因cDNA克隆與序列分析

根據(jù)丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的基因信息，發(fā)現(xiàn)1個丹參WRKY33抗逆基因，以此序列設(shè)計特異性引物，對丹參WRKY33進(jìn)行基因克隆。經(jīng)PCR擴增得到1條特異性片段，其大小約為1 600 bp，與預(yù)期大小長度一致（圖1-A）。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收后，連接至pMD19-T測序載體，使用大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌液送公司測序。對測序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列含有1 635 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼544個氨基酸（圖1-B），命名為SmWRKY33。在SmWRKY33基因的氨基酸組成中，絲氨酸（Ser）含量最高，占14.2%；其次為脯氨酸（Pro）含量，占9.5%；色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）含量最低，各占0.7%。

利用ProtParam在線軟件分析SmWRKY33蛋白的理化性質(zhì)，SmWRKY33蛋白的相對分子量為60 835.66，等電點為7.00，分子式為C2 641H4 039N769O862S15，不穩(wěn)定指數(shù)為69.58，脂肪族指數(shù)為46.60，總平均親水性為-1.007，歸類為不穩(wěn)定親水蛋白。ExPasy-ProtSCale在線軟件分析SmWRKY33蛋白親/疏水性，結(jié)果顯示，SmWRKY33蛋白疏水性最強的位點是第108個氨基酸，疏水最高值為1.889；親水性最強的位點是第133個氨基酸，親水性最低值為 -3.156（圖2-A）。但從整條肽鏈的預(yù)測值結(jié)果分析來看，該蛋白整體趨于親水性，為親水蛋白。

2.2 丹參SmWRKY33基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對丹參SmWRKY33基因進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明，SmWRKY33基因的氨基酸序列與PfWRKY33（紫蘇，Perilla frutescens，KAH6798330.1）、PaWRKY33（白花泡桐，Paulownia fortunei，KAI3447833.1）、BuWRKY33（互葉醉魚草，Buddleja alternifolia，KAG8374463.1）、SeWRKY33（芝麻，Sesamum indicum，XP-011077504.1）的同源性較高，同源性分別為78.27%、73.39%、73.13%、66.78%（圖2-C）。在線軟件NCBI分析得出SmWRKY33基因有2個WRKY基因保守結(jié)構(gòu)域。利用MEGA 11軟件分析SmWRKY33基因氨基酸序列親緣關(guān)系，結(jié)果顯示SmWRKY33基因與紫蘇、芝麻、白花泡桐WRKY33親緣關(guān)系較近（圖2-B）。

在線軟件WoLF-PSORT預(yù)測SmWRKY33蛋白的亞細(xì)胞定位，該蛋白可能定位于細(xì)胞核。利用TMHMM Sever 2.0預(yù)測SmWRKY33蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白沒有存在跨膜結(jié)構(gòu)域，可能不屬于跨膜蛋白（圖3-A）。使用NetNGlyc 1.0 Server對SmWRKY33蛋白糖基化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白共有6個糖基化位點（圖3-B）。利用NetPhos 3.1 Server對SmWRKY33蛋白的磷酸化位點、蛋白激酶結(jié)合位點進(jìn)行分析（圖3-C），預(yù)測值大于0.5共發(fā)現(xiàn)149個磷酸化位點，分別含有絲氨酸（S）108個、蘇氨酸（T）27個、酪氨酸（Y）14個。SmWRKY33蛋白的信號肽使用在線軟件SignalP 4.1 Server進(jìn)行分析，C值、S值、Y值都小于閾值0.5，說明該蛋白沒有信號肽位點，屬于非分泌蛋白（圖3-D）。

2.3 丹參SmWRKY33蛋白二級三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA分析SmWRKY33蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，占77.39%，其次是延伸鏈、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角，各占10.48%、10.29%、1.84%（圖4-A）。結(jié)合在線軟件SWISS-Model建立SmWRKY33蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型，空間結(jié)構(gòu)以隨機卷曲為主，這與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相符（圖4-B）。

2.4 丹參SmWRKY33基因密碼子偏好性分析

利用CodonW、EMBOSS軟件分析丹參SmWRKY33基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index，CAI）、有效密碼子數(shù)（effective number of codons，ENC）、GC1s含量、GC2s含量、GC3s含量、總GC含量、同義密碼子相對適應(yīng)度（relative synonymous codon usage，RSCU）。結(jié)果表明，CAI為0.222、ENC為54.16，說明密碼子偏性較弱；總GC含量值0.4 979，其中GC1s、GC2s、GC3s含量值分別為0.4 752、0.4 569、0.5 615，說明該基因的A/U含量高于G/C含量。當(dāng)RSCU=1時，密碼子沒有偏好性；RSCU>1時，密碼子具有偏好性。表2中，RSCU>1的密碼子共有28個，其中A/U結(jié)尾有9個 G/C結(jié)尾有19個 說明丹參基因偏好于從數(shù)據(jù)庫CodcmUsage Database查找煙草（Nicotiana tabacum L.）、擬南芥［Arabidopsis thaliana（L.） Heynh.］、大腸桿菌（Escherichia coli）、酵母（Sacchammyces cerevisiae）基因組的密碼子偏好性，利用在線軟件EMBOSS-CHIP分析丹參SmWRKY33基因密碼子的使用頻率，表3列舉了丹參與其4個基因密碼子的使用頻率，分別用Sm/Nt、Sm/At、Sm/Ec、Sm/Sc來表達(dá)丹參SmWRKY33基因與煙草、擬南芥、大腸桿菌、酒釀酵母的密碼子使用頻率比值。若2個物種間密碼子使用頻率比值為0.5～2.0，則表明密碼子使用偏向比較接近，超過此范圍則差異較大。差異較大的密碼子個數(shù)越少，越有利于基因的異源表達(dá)。結(jié)果顯示，SmWRKY33與煙草、擬南芥、大腸桿菌、酒釀酵母分別有23、22、28、24個差異較大的密碼子，由此得出擬南芥真核表達(dá)最適應(yīng)丹參SmWRKY33基因的外源表達(dá)。

2.5 丹參SmWRKY33基因表達(dá)分析

利用熒光定量PCR分析丹參SmWRKY33基因在逆境脅迫下的相對表達(dá)量 結(jié)果表明SmWRKY33基因在低溫、高溫、PEG、NaCl等逆境脅迫下有不同程度的表達(dá)差異性。在低溫逆境脅迫下SmWRKY33基因的相對表達(dá)量顯著提高，在6 h時達(dá)到最高（圖5-A）；在高溫逆境處理下相對表達(dá)量較低（圖5-B），說明該基因參與丹參的低溫響應(yīng)機制。同時，為探究SmWRKY33基因在干旱、鹽脅迫下的表達(dá)模式，使用PEG、NaCl進(jìn)行逆境脅迫試驗。結(jié)果表明，在PEG處理下，SmWRKY33基因在不同時間點的表達(dá)量不同，在24 h表達(dá)量達(dá)到最高（圖5-C）。在NaCl處理下，SmWRKY33基因的相對表達(dá)量隨時間增加總體逐漸升高，但在24 h時出現(xiàn)下降的趨勢，隨后又逐漸上升，表明NaCl顯著誘導(dǎo)SmWRKY33基因的高表達(dá)（圖5-D）。SmWRKY33基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，該基因易受低溫和鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

丹參是我國傳統(tǒng)中藥材，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》所述，其皆為上品，因藥用部位根部呈紫紅色，被人們稱為“丹心”［12］。《本草綱目》原文記載丹參“小花成穗如蛾形，中有細(xì)子，其根皮丹而肉紫”，具有活血、治疝痛、通心包絡(luò)等作用［13］。Mei等闡述了不同溫度下丹參在干燥過程中產(chǎn)生的代謝變化，發(fā)現(xiàn) 100 ℃ 是丹參代謝物譜變化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點，主要表現(xiàn)為酶促催化生物合成（≤100 ℃） 和化學(xué)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化（≥100 ℃）［14］。Tong等將代謝組學(xué)與質(zhì)譜成像方法相結(jié)合，對丹參空間代謝組進(jìn)行生物合成，發(fā)現(xiàn)丹參素是丹參生產(chǎn)多種酚酸的重要前體［15］。意大利學(xué)者對丹參進(jìn)行研究，首次證明丹參中的丹參酮可以改善以奧沙利鉑為主進(jìn)行化療所帶來的神經(jīng)病理性疼痛，同時可以降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中癌細(xì)胞的發(fā)展速度［16］。

近年來，越來越多的研究證明轉(zhuǎn)錄因子在生物和非生物脅迫信號傳遞中起著關(guān)鍵作用，一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子在干旱/冷脅迫或干旱/熱激脅迫下可以同時被誘導(dǎo)，從而提高植物的抗逆性［17］。Chen等詳細(xì)闡述了WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫中的作用，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長過程中具有重要作用［18］。WRKY33作為WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，其轉(zhuǎn)錄活性依賴于MPK3/6介導(dǎo)的磷酸化。Wang等使用反向遺傳方法和酵母表達(dá)系統(tǒng)，明確了擬南芥轉(zhuǎn)錄因子WRKY33是通過與CesA8遠(yuǎn)端啟動子區(qū)域的W-box元件結(jié)合，直接調(diào)節(jié)CesA8的表達(dá)，參與植物的干旱生長機制［19］。Zhou等通過AtWRKY33基因?qū)ν粗参锓裌RKY33脅迫響應(yīng)中的功能分析，發(fā)現(xiàn)在植物生長過程中，WRKY33轉(zhuǎn)錄因子在植物結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上高度保守，可以有效保護(hù)植物免受生物和非生物的脅迫［20］。目前已經(jīng)從蘋果［21］、向日葵［22］、毛果楊［23］成功克隆出WRKY33，研究表明WRKY33轉(zhuǎn)錄因子可以提高植物的耐鹽性和抗旱性。

隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，越來越多WRKY基因家族的轉(zhuǎn)錄因子被相繼挖掘出來并進(jìn)行深入研究。Li等從玉米中克隆出ZmWRKY33，對其進(jìn)行干旱、高鹽、冷處理及ABA外源誘導(dǎo)試驗，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥具有更高的抗逆性［24］。本研究根據(jù)丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挖掘出丹參具有耐鹽性和抗旱性轉(zhuǎn)錄因子WRKY33，利用基因克隆技術(shù)首次從丹參中克隆了SmWRKY33基因，該基因全長為1 635 bp，編碼544個氨基酸。利用在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，SmWRKY33蛋白的相對分子量為60 835.66，等電點為7.00，分子式為C2? 641H4 039N769O862S15，為不穩(wěn)定親水蛋白。親緣關(guān)系分析顯示SmWRKY33與紫蘇、芝麻、白花泡桐的WRKY33親緣關(guān)系較近。利用在線軟件WOLF PSORT 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示丹參SmWRKY33蛋白可能定位于細(xì)胞核中。熒光定量PCR分析SmWRKY33基因在低溫、高溫、PEG、NaCl處理下的相對表達(dá)量情況，結(jié)果顯示SmWRKY33基因易受低溫、NaCl誘導(dǎo)表達(dá)，說明SmWRKY33基因參與了丹參在生長過程中耐低溫和耐鹽機制。本研究利用基因克隆技術(shù)，初步探討了SmWRKY33的生物學(xué)功能，以期為培育丹參抗逆新品種提供理論支撐。

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