miRNA-21、白細(xì)胞介素-17、缺氧誘導(dǎo)因子-1α在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)水平及臨床意義

楊曉煜，朱登勤，龐素蕾，王盼盼，馬若巾，馬云云，宋春鴿

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，鄭州 450052

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，其特征為骨髓瘤細(xì)胞在骨髓內(nèi)克隆性增殖及髓外浸潤，臨床主要表現(xiàn)為骨痛、貧血、感染、腎功能不全等[1-2]。目前，多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制尚不明確。有研究認(rèn)為，細(xì)胞遺傳學(xué)、造血微環(huán)境與骨髓瘤細(xì)胞之間的相互作用及多種信號(hào)通路等可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）在細(xì)胞增殖、代謝、分化等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5]。有研究表明，miRNA-21 在多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞中高表達(dá)，其可能通過靶向調(diào)控Krüppel 樣因子5（Krüpple-like factor 5，KLF5）的表達(dá)促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖[6]。另有研究表明，造血微環(huán)境中，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β等細(xì)胞因子在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖及破骨細(xì)胞的激活等方面發(fā)揮著重要作用[7]。IL-17 也與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病過程密切相關(guān)[8]。IL-17 是一種促炎因子，可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)特定的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，引起IL-6、IL-1β等炎癥因子表達(dá)升高，從而促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的生長[9]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是在缺氧條件下廣泛存在于人體的一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡，參與腫瘤新生血管的生成過程[10-11]。相關(guān)研究顯示，下調(diào)HIF-1α的表達(dá)可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，表明HIF-1α高表達(dá)會(huì)促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖[12]。本研究探討miRNA-21、IL-17、HIF-1α在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)及臨床意義，以期為多發(fā)性骨髓瘤的早期防治提供一定的參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年2 月至2021 年2 月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院收治的多發(fā)性骨髓瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2015 年修訂）》[13]中多發(fā)性骨髓瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥18歲；③出院后隨訪2 年；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并自身免疫性疾病；③合并全身感染性疾病；④合并其他血液系統(tǒng)疾病；⑤近1 個(gè)月內(nèi)接受過對(duì)癥治療；⑥參與其他研究性試驗(yàn)。依據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入78例多發(fā)性骨髓瘤患者作為研究組，其中男42例，女36例；年齡35～68 歲，平均（52.37±7.97）歲；病程2～7 年，平均（4.35±1.02）年；TNM分期：Ⅰ期38例，Ⅱ期24例，Ⅲ期16 例。另選取同期于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院體檢的64 例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男34 例，女30 例；年齡37～69 歲，平均（53.24±8.04）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測血清miRNA-21 水平采集兩組受試者的空腹靜脈血200 μl，按照試劑盒說明書步驟提取血漿中的總RNA，采用核酸紫外分析儀檢測總RNA 的濃度。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-21 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清IL-17、HIF-1α水平 采集兩組受試者的空腹靜脈血3 ml，2500 r/min 離心10 min 后取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清IL-17、HIF-1α水平。HIF-1α試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司。IL-17 試劑盒購自廣州市睿信生物科技有限公司。

1.3 隨訪方法

對(duì)78 例多發(fā)性骨髓瘤患者隨訪2 年，根據(jù)隨訪結(jié)果將患者分為預(yù)后良好及預(yù)后不良，生存為預(yù)后良好，死亡為預(yù)后不良。隨訪截止時(shí)間為2023 年2 月。

1.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①比較兩組受試者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平。②比較不同預(yù)后情況多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平。③分析多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平的相關(guān)性。④分析miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值。⑤分析多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的影響因素。⑥分析miRNA-21、IL-17、HIF-1α對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。⑦比較不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達(dá)情況多發(fā)性骨髓瘤患者的生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)分析法分析多發(fā)性骨髓瘤患者血清miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平的相關(guān)性；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），分析miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值及對(duì)預(yù)后的預(yù)測價(jià)值；采用Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的影響因素；繪制Kaplan-Meier 生存曲線，比較不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達(dá)情況多發(fā)性骨髓瘤患者的生存情況。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較

研究組患者的血清miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 兩組受試者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較（±s）

表1 兩組受試者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較（±s）

組別研究組（n=78）對(duì)照組（n=64）t值P值miRNA-21 5.03±1.54 2.94±0.68 10.076 0.000 IL-17（pg/ml）28.44±4.47 23.67±4.05 6.598 0.000 HIF-1α（ng/ml）1.38±0.47 0.42±0.13 15.842 0.000

2.2 不同預(yù)后情況多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較

預(yù)后不良多發(fā)性骨髓瘤患者血清miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平均明顯高于預(yù)后良好患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表2）

表2 不同預(yù)后情況多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較（±s）

表2 不同預(yù)后情況多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平的比較（±s）

預(yù)后不良（n=20）良好（n=58）t值P值miRNA-21 5.87±1.65 4.74±1.32 3.091 0.003 IL-17（pg/ml）30.29±3.26 27.80±3.07 3.079 0.003 HIF-1α（ng/ml）1.57±0.29 1.31±0.25 3.848 0.000

2.3 多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平均呈正相關(guān)（r=0.447、0.462，P﹤0.05）。

2.4 miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值

ROC 曲線顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α聯(lián)合檢測診斷多發(fā)性骨髓瘤的AUC、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均高于三者單獨(dú)檢測。（圖1、表3）

圖1 miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測診斷多發(fā)性骨髓瘤的ROC曲線

表3 miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值

2.5 多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的影響因素分析

以miRNA-21、IL-17、HIF-1α為自變量，多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后情況為因變量構(gòu)建Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型，結(jié)果顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α均是多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P﹤0.05）。（表4）

表4 多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后影響因素的Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析

2.6 miRNA-21、IL-17、HIF-1α對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

ROC 曲線顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α聯(lián)合檢測預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的AUC、靈敏度、陰性預(yù)測值均高于三者單獨(dú)檢測。（圖2、表5）

圖2 血清miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的ROC曲線

表5 miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

2.7 不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達(dá)情況多發(fā)性骨髓瘤患者生存情況的比較

依據(jù)2.6 中miRNA-21、IL-17、HIF-1α的最佳截?cái)嘀担?.3、29.8 pg/ml 和1.3 ng/ml）將多發(fā)性骨髓瘤患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。采用Kaplan-Meier 生存曲線比較兩組患者的生存情況，結(jié)果顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α高表達(dá)組患者的2 年累積生存率均低于低表達(dá)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖3）

圖3 不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達(dá)情況多發(fā)性骨髓瘤患者的生存曲線

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢且病死率較高，主要表現(xiàn)為骨髓漿細(xì)胞異常增生和單克隆免疫球蛋白過度生成，導(dǎo)致免疫缺陷和骨骼破壞[14]。早發(fā)現(xiàn)、早防治是改善多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵。現(xiàn)階段常用的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（免疫球蛋白、尿本周蛋白等）對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷及預(yù)后預(yù)測的靈敏度普遍較低，故探索新的診斷多發(fā)性骨髓瘤的生物標(biāo)志物仍然是臨床研究的重點(diǎn)方向。miRNA 是一種小分子非編碼RNA，與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展存在一定相關(guān)性。其中miRNA-21 是研究相對(duì)較多的miRNA，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[15]。IL-17 是由輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）17 分泌的促炎因子，通過誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)來促進(jìn)骨髓腫瘤細(xì)胞的生長，在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要[16]。HIF-1α是一種在腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧、能量代謝、血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，在多發(fā)性骨髓瘤中高表達(dá)[17]。本研究探討miRNA-21、IL-17、HIF-1α在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)果顯示，研究組患者的miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平均明顯高于對(duì)照組，表明多發(fā)性骨髓瘤患者的miRNA-21、IL-17、HIF-1α均高表達(dá)，提示其可以作為診斷多發(fā)性骨髓瘤的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究結(jié)果還顯示，預(yù)后不良多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21、IL-17、HIF-1α水平均明顯高于預(yù)后良好患者，進(jìn)一步提示miRNA-21、IL-17、HIF-1α可以預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后。朱廣偉等[18]研究表明，miRNA-21 在多發(fā)性骨髓瘤患者中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者的血液學(xué)指標(biāo)顯著相關(guān)，可以預(yù)測患者的預(yù)后，這與本研究結(jié)果相似。譚昱等[19]研究表明，多發(fā)性骨髓瘤患者IL-17的表達(dá)明顯上調(diào)，且其表達(dá)水平與病理分期相關(guān)，提示IL-17 可能與多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后存在一定關(guān)系，也與本研究結(jié)果相似。本研究采用Pearson 相關(guān)分析法分析多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21 水平與IL-17、HIF-1α水平均呈正相關(guān)（r=0.447、0.462，P﹤0.05），表明多發(fā)性骨髓瘤患者miRNA-21 水平升高，則IL-17 和HIF-1α水平也隨之升高。分析原因可能與miRNA-21 對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者Th17 細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，也可能與miRNA-21/程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）、miRNA-21/磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[20-22]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α均是多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并進(jìn)一步分析了miRNA-21、IL-17、HIF-1α單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值及對(duì)預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。ROC 曲線顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α聯(lián)合檢測診斷多發(fā)性骨髓瘤的AUC、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均高于三者單獨(dú)檢測；miRNA-21、IL-17、HIF-1α聯(lián)合檢測預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的AUC、靈敏度、陰性預(yù)測值均高于三者單獨(dú)檢測。表明miRNA-21、IL-17、HIF-1α三者聯(lián)合檢測可較好地診斷多發(fā)性骨髓瘤及預(yù)測預(yù)后。本研究還分析了不同miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達(dá)情況的多發(fā)性骨髓瘤患者的生存情況，結(jié)果顯示，miRNA-21、IL-17、HIF-1α高表達(dá)組患者的2年累積生存率均低于低表達(dá)組患者，提示多發(fā)性骨髓瘤患者的miRNA-21、IL-17、HIF-1α表達(dá)水平越高，患者生存率越低，進(jìn)一步表明miRNA-21、IL-17、HIF-1α能較好地預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后。

綜上所述，多發(fā)性骨髓瘤患者中miRNA-21、IL-17、HIF-1α 均高表達(dá)，且miRNA-21 與IL-17、HIF-1α水平均呈正相關(guān)，三者聯(lián)合檢測可較好地診斷多發(fā)性骨髓瘤及預(yù)測預(yù)后，有助于臨床及早采取有效的防治措施，改善多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后情況。