CLK2 mRNA 在早期雞胚中的表達及定位分析

房燁虹,齊 川,周發亮,趙 鵬,張若儀,趙海莉,任麗莉,劉 超,肖建英,劉乙蒙*

(1.錦州醫科大學,遼寧 錦州 121000;2.錦州市婦嬰醫院遺傳科,遼寧 錦州 121000;3.山東省濱州市中心醫院口腔科,山東 濱州 251700 4.錦州醫科大學基礎醫學院,遼寧 錦州 121000)

CLK基因編碼的雙特異性蛋白激酶CLK(CDK-like kinase)家族有四個成員:CLK1,CLK2,CLK3和CLK4。這四種激酶蛋白的C端均有一段高度保守的序列,對應著一個相同的氨基酸基序EHLAMMERILG,因此這些蛋白激酶又被稱為LAMMER蛋白激酶[1]。其中,CLK2可使剪接體復合物的SR蛋白磷酸化從而調節RNA的選擇性剪接[2]。這種調節機制廣泛存在于生物體內,參與細胞周期進程、基因表達、細胞凋亡、胚胎發育、和端粒長度調節等生理過程。

CLK2在眾多真核生物都有表達[3],近年來被發現在乳腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、肝癌等腫瘤組織中呈高表達,提示其可能是一種促癌激酶。除此之外,一些研究發現CLK2表達的抑制,可促使早期軟骨的形成[11];對CLK2的抑制同時能抑制Wnt通路,從而促進細胞的分化,減輕炎癥反應,促使大鼠肌腱損傷的修復[12];而CLK2在早期胚胎中的表達及其對發育的影響還未見報道。前期研究表明,CLK家族的另一成員CLK1在早期雞胚發育過程中存在一定的表達特點[4]。為了進一步研究CLK家族在早期胚胎中表達及其作用,本研究構建相關質粒及探針,利用qPCR和原位雜交檢測CLK2 mRNA在早期雞胚發育中的表達及定位,為進一步研究CLK2及其整個家族在雞胚中的功能和作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

錦州醫科大學畜牧獸醫學院提供受精雞蛋;pMD18-T Cloning Kit試劑盒、限制性內切酶Hind III 和Xba I購自Takera公司;從羅氏公司購得地高辛標記試劑盒;從invitrogen公司購得Platinum實時定量PCR試劑盒;從TransGen公司購得感受態細胞DH5α菌株。

1.2 雞胚胎的制備

將受精雞蛋放于37 ℃孵育箱中孵育到相應的階段,根據漢伯格及漢密爾頓[5](Hamburger V,Hamilton HL)分期,孵化時間:4期12～13 h,6期23～25 h,8期26～29 h,10期33～38 h。敲除小部分蛋殼并用無菌注射器抽出大部分蛋清,以干燥潔凈濾紙覆蓋雞的胚胎,隨后小心沿邊緣剪下胚胎并放入PBS緩沖液中,待用。

1.3 qPCR

qPCR結果利用SPSS 17.0進行統計分析,以 qPCR結果的2-△△CT做柱狀圖。組間比較采用t檢驗,P<0.01為差異有顯著統計學意義。

1.4 CLK2重組質粒的構建

以早期雞胚cDNA為模板,在反應體系中加入特異性引物,通過PCR實現目的片段擴增,其長度為574 bp。PCR擴增條件如下:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個循環;72 ℃ 10 min。上述步驟結束后進行電泳,以鑒定PCR產物。收集產物并進行純化。連接目的基因與載體、轉化、選取陽性克隆進行擴增培養,繼而提取質粒,分別以HindIII和XbaI進行雙酶切,隨后送測序分析以進一步檢驗。

1.5 正、反義探針的合成

擴增測序后正確的質粒,采用XbaI和HindIII 進行酶切,使其線性化。以上一步得到的酶切片段為模板,通過T7體外轉錄,合成正、反義探針,并用地高辛標記探針;隨后進行電泳,以明確反義探針的濃度及大小。若電泳條帶清晰,且與預期大小一致,則將被用于后續操作。

1.6 原位雜交

使用PBS緩沖液洗滌先前待用的雞胚胎2次,每5 min 1次;將蛋白酶K加入洗滌過的雞胚5 min,使之分解;隨后再次清洗1次,PBS 5 min;將雞胚放入4%多聚甲醛溶液中固定10 min;以含有0.25%乙酸酐的DPEC去離子水處理10 min;加入預雜交液反應1 h,條件65 ℃,加入新雜交液過夜,反應條件70 ℃。上述步驟結束后在65 ℃下使用Hyb wash清洗兩次以回收探針,每次5 min;洗滌后用含有2%的BBR和20%的FBS的MABT抗體稀釋液封閉液室溫封閉2 h,anti-DIG經1∶2000稀釋,4 ℃搖床過夜;將處理好的雞胚用MABT充分洗滌兩次,每次各30 min;加入染料顯色,拍照。

2 結果與分析

2.1 qPCR檢測CLK2 mRNA的表達

根據Hamburger-Hamilton(HH)分期法[5]制備了4種發育階段的雞胚,分別為4期、6期、8期和10期,提取各早期雞胚總RNA,通過逆轉錄分別得到各個時期的cDNA,并進行驗證。結果顯示(見圖1),CLK2 mRNA在早期雞胚中的4、6、8、10期中均有表達且程度不同,其中在6、10期表達明顯高于4、8期(P<0.01)。

圖1 qPCR檢查CLK2 mRNA在早期雞胚中的表達

2.2 重組質粒的構建及鑒定

按預先設計的PCR體系進行PCR擴增獲得大小為571 bp的CLK2片段(見圖2A)。收集此片段并克隆到PMD18-T Vector上,用XbaI 和HindIII進行雙酶切鑒定(見圖2B),將酶切鑒定正確的陽性克隆進行DNA測序分析,經比對后正確。

2.3 原位雜交檢測CLK2 mRNA的表達

為進一步驗證CLK2 mRNA在早期雞胚中的表達定位,分別選取4、8、11期雞胚,利用原位雜交檢測CLK2 mRNA的表達定位。原位雜交結果表明,4期(原腸胚時期)雞胚的CLK2 mRNA在上胚層與下胚層均有不同程度表達,其集中分布于亨氏節附近,此外,在原條等部位也有少量表達。8期時,CLK2 mRNA分布于內、中、外三個胚層的不同部位,主要表達在頭部、神經板和神經褶處,而在亨氏節、脊索、原條、體節處表達不那么強烈(圖3B);在11期中,CLK2的mRNA主要表達于眼泡和頭部部位,其他的部位例如神經管、脊索、體節處表達稍弱(圖3C)。

圖3 原位雜交檢測CLK2 mRNA在4、8、11期雞胚中的表達

3 討 論

CLK2在多種真核生物的組織中均有廣泛表達,然而在雞胚中是否存在還未有定論。之前的研究證實了與CLK2同家族的另外一個成員CLK1的 mRNA在雞胚中存在且表達[4],本研究通過qPCR檢測到CLK2 mRNA在4期雞胚中就開始表達,在6期表達上升(P<0.01),在8期較先前表達水平略有下降,到10期,其表達水平出現顯著增高(P<0.01)。10期時某些細胞增殖活躍,CLK2 mRNA表達水平的明顯升高有可能預示著其與這些細胞的發育有密切聯系。

研究發現,在肝臟進行糖異生與脂肪酸的氧化過程中,CLK2的參與是必不可少的[6-7]。對秀麗隱桿線蟲的研究表明,其CLK2基因突變會導致多種生理指標的變化,包括胚胎生長發育與繁殖的速度改變等[8]。本試驗制備了CLK2 mRNA探針并以地高辛標記,成功構建CLK2/pMD18-T質粒,并從雞早期胚胎發育的三個階段-原腸胚形成期(HH3-5),體節形成期(HH7-8)和神經胚形成期(HH9+)中各挑選一個時期,通過原位雜交,檢測CLK2蛋白激酶在雞胚早期發育過程中的表達及定位。原位雜交結果顯示,CLK2 mRNA在4期(原腸胚時期)于亨氏節的表達最為明顯,之前的研究表明[4],此期CLK1 mRNA主要集中于原條周圍均勻表達,而在8期(體節形成期)和11期(神經胚形成期)時,二者的表達模式十分相似-都呈現一種頭尾豐富表達的模式,其中CLK1[9]和CLK2[9]在頭部的表達總是最為強烈,這也許預示著二者的表達與神經上皮細胞的增殖有關,比如眼等某些頭部器官;在胚胎中部,神經管及周圍,二者含量稍少;另外,在胚胎尾部,神經溝、神經板等部位,CLK1與CLK2均呈現為高表達。DOA是CLK家族在果蠅中的同源蛋白[1],有研究結果顯示,缺乏DOA可以導致胚胎致死和分化缺陷,可造成果蠅眼部發育畸形和神經元發育畸形。亦有研究發現,下丘腦神經元中CLK1和CLK2的表達活躍,且其在很大程度上影響著神經元功能的發揮[10]。而本研究結果也提示,在雞胚早期神經系統發育過程中,CLK1和CLK2也扮演著不可或缺的角色。

4 結 論

早期雞胚發育過程中,CLK2 mRNA存在且其表達呈現隨發育階段變化而改變的特點,其表達部位顯示CLK2可能是影響神經系統及頭部發育的重要因素之一,但其在胚胎發育中的具體作用及作用機制仍需更深層次的探究。