定海灣龜足腸道微生物組成及代謝組分析

摘 要：為了解定海灣龜足腸道微生物群落結構特點及代謝組特征，探索龜足生存環境、食性及腸道微生物組成之間的聯系，使用16S rRNA 高通量測序技術和非靶向代謝組學技術，對采集的龜足樣品進行分析。結果表明：龜足腸道菌群在門水平上，最優勢菌門為變形菌門，含量為47.17%， 其次為擬桿菌門， 含量為40.61%； 在綱水平上， 最優勢綱為擬桿菌綱， 含量為40.59%，其次為γ 變形菌綱，含量為32.62%；在屬水平上，最優勢屬為Sediminibacterium，含量為22.77%，其次為Pseudarcicella，含量為10.97%，還存在較多未能培養和未能鑒定的菌屬。龜足腸道代謝物中含量最多的為脂類及類脂物質，約占代謝物總量的31%，其次為有機酸及其衍生物，約占代謝物總含量的23%。

關鍵詞：定海灣；龜足；腸道微生物；代謝組

中圖分類號：S917 文獻標志碼：A 文章編號：0253?2301（2024）11?0009?09

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.11.002

龜足Capitulum mitella（ Linnaeus，1 758）， 俗稱佛手、觀音掌、龜腳等，因形似龜腳而得名，隸屬節肢動物門、甲殼綱、顎足綱、鞘甲亞綱、蔓足下綱、圍胸總目、有柄目、指茗荷科、龜足屬，在我國主要分布于長江口以南沿海的礁石縫隙。當前國內外對龜足均有一定的研究，國內主要集中在生長發育[1?9]、地理分布[10]、人工培育[11?12] 、食性和營養轉化[13?14]等方面；國外相關研究較少，主要對龜足性腺發育及基因多樣性[15?16]進行了探究，但關于龜足腸道微生物組成及代謝組分析的研究還未見報道。目前龜足作為有柄類的代表，與無柄類藤壺相比污損性較小，肉質細嫩，味道鮮美，含有豐富的氨基酸、多不飽和脂肪酸及礦物元素，具有一定的營養價值和經濟價值[13， 17]。因龜足野外資源的過度開發，當前已不能滿足市場供應需求，使用高通量測序技術及非靶向代謝組學技術對龜足腸道微生物進行分析可以更好了解環境和餌料對其生長發育的影響，加速推進實現規?；斯ゐB殖。

腸道微生物在宿主體內發揮重要作用，通過對復雜腸道微生物的組成、功能分析，可以解釋宿主食性和腸道微生物之間的相互關系。隨著測序技術的發展，基于16S rRNA 的高通量測序技術能夠對微生物群落的種類及數量進行精確分析，逐漸成為研究微生物群落結構的主要技術手段，并已廣泛應用于腸道微生物方面的研究[18?21]。對龜足腸道微生物進行相關分析可以更全面解析腸道細菌的群落結構及其種類。代謝組學是一門利用高通量、高靈敏度和高分辨率的現代分析儀器，對細胞、體液或組織中所有代謝物進行無偏向的定性和定量分析的學科[22]。非靶向代謝組學分析（如LC-MS）具有諸多優勢，包括對樣品制備的要求較低、靈敏度高、動態范圍廣，以及能夠檢測濃度差異較大的代謝物，因此在代謝組學研究中得到廣泛應用。采用非靶向代謝組學技術對龜足腸道樣品進行分析，可以了解其代謝組特征。本研究使用上述兩項技術對野生龜足的腸道微生物群落組成和代謝組特征進行了分析，綜合二者分析結果可以進一步改善龜足配合飼料的營養成分并優化其飼料配方，為龜足營養學的研究奠定基礎，也為龜足的人工繁育和養殖提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 龜足樣品采集與處理

本試驗所用龜足樣品取自福州連江定海村青嶼潮間帶（ 119.810 E， 26.259 N）， 取樣時間為2022 年7 月，選取發育良好、健壯的成體龜足，低溫保存當日帶回實驗室進行后續樣品處理。龜足形態學數據如下：峰吻徑22.53±2.84 mm、頭狀部長18.37±1.54 mm、全長31.17±3.08 mm、體重3.41±0.69 g。

將龜足置于滅菌解剖盤中，用無菌棉球蘸取75% 酒精擦拭龜足體表，再用無菌海水沖洗，之后用滅菌手術剪剪開龜足柄部、頭狀部，取出“U”型腸道，修去腸道表面多余的脂肪組織和其他物質，最后用無菌PBS 沖洗干凈后裝于2 mL 離心管。將收集好的樣品全部混勻后均分到9 個離心管中，取其中3 管分別標記為Y1、Y2、Y3，用于腸道微生物群落結構分析，剩余6 管分別標記為DX1-DX6，用于腸道代謝組分析。全部樣品液氮速凍后置于?80℃ 冰箱冷凍保存。

1.2 龜足腸道微生物組成樣品提取與處理

1.2.1 龜足腸道樣品總DNA 的提取、擴增與檢驗

使用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生物）對龜足腸道樣品基因組DNA 進行提取，提取后使用Nanodrop 微量分光光度計對樣品濃度和質量進行檢測。用所提取的基因組DNA 為模板，將16S rRNA 的V3～V4 區作為擴增目的條帶，設計引物進行RCR 擴增。擴增體系為樣品DNA 30 ng、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、3 μL BSA、12.5 μL2×Taq Plus Master Mix、7.5 μL ddH2O。擴增條件為94℃ 5min； 94℃ 30 s， 50℃ 30 s， 72℃ 60 s，循環數30；72℃ 7 min。擴增產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，并用Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒純化。所使用的16S rRNA V3～V4 區引物序列見表1。

1.2.2 龜足腸道樣品高通量測序

擴增純化后的DNA 樣品送由北京奧維森（allwegene）基因科技有有限公司進行測序，設置3 個平行重復，進行Miseq 文庫構建及Miseq 上機測序。

1.2.3 數據質控及OTU 基礎分析

操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）是在系統發生學或群體遺傳學等研究中，為便于分析而人為設定的標識，用于了解樣品測序結果中的細菌種類及其分類信息。當測序序列相似度達到97% 以上時， 將其歸入同一OTU 進行后續分析。使用Qiime（版本1.8.0）和Vsearch（版本2.7.1）平臺及軟件，通過聚類或降噪方式生成OTUs。聚類方法可選擇uparse [23]、uclust [24]、cdhit [25]或ref 參照數據庫等方法，降噪法可選擇unoise3 [26]。默認情況下，使用uparse 聚類法。

原始數據在測序完成后以Fastq 格式保存，通過Miseq 測序獲得雙端序列（Pair-End，PE）數據。對獲取的Fastq 數據進行質量控制處理，最終得到高質量的Fasta 數據。具體步驟如下：（1）使用Trimmomatic（版本0.36）和Pear（版本0.9.6）對Fastq（版本1.20）數據進行質控。Trimmomatic 采用滑動窗口法，設置窗口大小為50 bp，平均質量值設為20，最低保留序列長度為120 bp，具有“N”的序列則使用Pear 進行去除，以提高數據的質量與分析的準確性；（2）使用Flash 和Pear 程序依據雙端序列的重疊關系進行拼接，設置最小重疊為10 bp，錯配率為0.1，以獲得Fasta 序列；（ 3） 基于已知數據庫， 使用uchime 程序去除Fasta 序列中的嵌合體，對于未知數據庫則采用自比對技術進行去除，同時清除不符合標準的短序列。下機數據（Raw PE）在過濾低質量Fastq 數據后（如去除條形碼和引物），拼接得到raw_tags，進一步去除嵌合體和短序列后獲得高質量序列clean_tags。

基于OTU 聚類結果，使用奧維森在線云平臺相關程序和軟件進行分析，繪制樣品的稀釋曲線（Rarefaction curve）、香農曲線（Shannon-Wienercurve），同時對樣品的Alpha 多樣性指數進行統計。采用Blast [24]、RDP Classifier [27]等軟件或算法對OTU 代表序列進行比對分析，并在3 個水平（門、綱、屬）注釋其群落的物種信息，并分別繪制堆疊柱狀圖來反映群落結構組成情況。

1.3 龜足腸道微生物代謝組樣品提取與處理

1.3.1 代謝物的提取與分析

取25 mg 樣品，加入500 μL 提取液，提取液由甲醇、乙腈和水按體積比2∶2∶1 混合，并加入同位素標記的內標混合物。樣品在SCIENTZ-48 研磨儀上以35 Hz 的頻率研磨4 min，隨后在SB25-12D 超聲波清洗儀中于冰水浴條件下超聲處理5 min，重復此過程3 次。處理后的樣品在?40℃ 下靜置1 h，隨后在4℃、12 000 r·min?1 條件下離心15 min。收集上清液，并將其轉移至進樣瓶進行檢測，另外等量的上清液被混合并作為質控（QC）樣品進行檢測。

使用Vanquish 超高效液相色譜儀（ ThermoFisher Scientific）與ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（Waters）對目標化合物進行分離。液相色譜的A 相為含有25 mmol·L?1 乙酸銨和25 mmol·L?1氨水的水相，B 相為乙腈。樣品盤溫度設定為4℃，進樣體積為2 μL。通過Thermo Q ExactiveHFX 質譜儀（Thermo Fisher Scientific），在Xcalibur控制軟件的輔助下采集一級和二級質譜數據。具體參數設置為：（1）套管氣流速：30 Arb；（2）輔助氣流速： 25 Arb；（ 3） 毛細管溫度： 35℃；（4）全掃描分辨率：120 000；（5）MS/MS 分辨率：7 500；（6）碰撞能量：10/30/60（NCE 模式）；（7）噴霧電壓：正極3.6 kV 或負極?3.2 kV。

1.3.2 數據處理

將原始數據使用ProteoWizard 軟件處理并轉換為mzXML 格式，然后利用R 程序包進行峰的識別、提取、對齊和積分，最后與二級質譜數據庫進行匹配以實現物質注釋。主要步驟包括：（1）過濾單個峰值，保留缺失值在實際樣品中小于50% 的峰；（2）對數據進行標準化處理，采用每個樣品特征總和進行歸一化；（3）模擬原始數據中的缺失值以獲得鑒定物數量；（4）進行鑒定物的注釋分析。

2 結果與分析

2.1 龜足腸道微生物群落結構分析

2.1.1 龜足腸道微生物測序條帶篩選

龜足腸道樣品測序共得到原始條帶119 741.33±19 249 個，優質條帶108 277.67±18 222 個。經過數據質控處理最終得到的優質序列長度主要分布在400～440 bp。

2.1.2 龜足腸道微生物樣品稀釋曲線

使用隨機抽樣的方法對序列進行抽取，基于抽取的序列數量及其所代表的OTU 數量構建樣品稀釋曲線。稀釋曲線可以反映樣品的測序深度情況。當曲線趨于平坦時，表示測序數據量已足夠。由圖1 可知，本次龜足腸道樣品3 個組內平行曲線重合度高，曲線在樣品讀數（Number of reads sample）大于10 000 之后逐漸趨于平緩，說明本次測序數量符合要求。

2.1.3 龜足腸道微生物樣品香農曲線

香農曲線可用來體現樣品在不同測序深度時微生物的多樣性情況。樣品的微生物多樣性越高，香農指數（shannon）越大。由圖2 可知，3 個組內平行樣品曲線重合度高，香農指數在4 左右，表明本次所測龜足腸道樣品組內的重復性較好且微生物豐富度較高。

2.1.4 龜足腸道樣品門水平細菌群落結構

由圖3可知，在門分類水平上，龜足腸道樣品中主要鑒定到變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidota、放線菌門Actinobacteriota、髕骨菌門Patescibacteria、疣微菌門Verrucomicrobiota、厚壁菌門Firmicutes、蛭弧菌門Bdellovibrionota、藍藻門Cyanobacteria、Methylomirabilota、彎曲桿菌門Campilobacterota、酸桿菌門Acidobacteriota、硝化菌門Nitrospirota、Dependentiae、粘球菌門Myxococcota、迷蹤菌門Elusimicrobiota、MarinimicrobiaSAR406_clade、DTB120、綠彎菌門Chloroflexi、Margulisbacteria、浮霉菌門Planctomycetota、SAR324_clade_Marine_group_B、MBNT15、WOR-1、梭桿菌門Fusobacteriota、螺旋體門Spirochaetota 及少量其他菌門。

由表2 可知，龜足腸道樣品的最優勢菌門為變形菌門，含量大于1% 的菌群門類數量有5 種，其他菌門含量均小于1%，選擇合并。

2.1.5 龜足腸道樣品綱水平細菌群落結構

由圖4可知，在綱分類水平上，龜足腸道樣品中主要鑒定到擬桿菌綱Bacteroidia、γ 變形菌綱Gammaproteobacteria、α 變形菌綱Alphaproteobacteria、放線菌綱Actinobacteria、Omnitrophia、Gracilibacteria、Bdellovibrionia、藍藻綱Cyanobacteriia、Methylomirabilia、梭菌綱Clostridia、芽孢桿菌綱Bacilli、酸微菌綱Acidimicrobiia、Vampirivibrionia、彎曲桿菌綱Campylobacteria、Babeliae、脫鹵脫亞硫酸菌綱Desulfitobacteriia、Vicinamibacteria、uncultured_bacterium、硝化螺旋菌綱Nitrospiria、Oligoflexia等菌綱。

由表3 可知，龜足腸道樣品的最優勢綱類為擬桿菌綱Bacteroidia，含量大于1% 的菌群綱類數量有5 種，其他綱類含量小于1%。

2.1.6 龜足腸道樣品屬水平細菌群落結構

由圖5可知，在屬分類水平上，龜足腸道樣品中鑒定到沉積物桿狀菌屬Sediminibacterium、Pseudarcicella、Limnohabitans、新鞘氨醇菌屬Novosphingobium、uncultured、假單胞菌屬Pseudomonas、Rhodoluna、萊茵海默氏菌屬Rheinheimera、黃質菌屬Flavobacterium、unidentified、嗜麥芽寡單胞菌屬Stenotrophomonas、不動桿菌屬Acinetobacter、Aurantimicrobium、假紅桿菌屬Pseudorhodobacter、Arcicella、Fluviicola、Candidatus_Omnitrophus、苯基桿菌屬Phenylobacterium、C39、Fluviicoccus等菌屬。

由表4 可知，龜足腸道最優勢菌屬為Sediminibacterium，含量大于1% 的菌群屬類數量有13 種，其他屬類含量小于1%，此外還有較多uncultured（5.47%）和unidentified（2.79%）的菌屬。

2.1.7 龜足腸道微生物Alpha 多樣性分析

對龜足腸道微生物樣品進行Alpha 多樣性分析，可運用統計學方法快速評估菌群的豐富度及群落多樣性。Alpha 多樣性分析中的各項指數結果如下：Chao1指數 1 115.92±145.65、Observed_species 指數854.00±91.99、 PD_whole_tree 指數 78.69±7.85、Simpson 指數 0.87±0.02。

2.1.8 龜足腸道微生物功能預測

由表5 可知，基于龜足腸道樣品的KEGG 比對獲得的功能信息總共包含32 種代謝功能。KEGG 代謝通路分析表明， 排名前3 的二級功能分別為氨基酸代謝（ Amino acid metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）和輔助因子與維生素代謝（ Metabolism of cofactors and vitamins）， 其占比分別為13.48%、12.94% 和12.58%。

2.2 龜足腸道代謝組分析

2.2.1 代謝物種類分析

對共6 個龜足腸道樣品進行基于非靶向代謝組學技術的代謝分析，共檢測到1 288 個代謝物，其中相對定量均值排名前50 的代謝物名稱見圖6。

2.2.2 代謝物分類

對龜足全部腸道樣品代謝物進行分類，在二級分類水平共鑒定到13 類代謝物，結果見圖7。 其中，脂類和類脂分子含量最多，例如前列腺素、雄激素、花生四烯酸、?；撬?、二十二碳六烯酸等，占總代謝物的31%；其次是有機酸及其衍生物，例如甲酸、蘋果酸、乳酸、丁酸、乙醛酸、琥珀酸、多巴胺、谷胱甘肽、甜菜堿等，占總代謝物的23%。

本次檢測還在龜足腸道樣品中發現了較多的氨基酸種類，除了對于人體常見的8 種必需氨基酸外，還含有甘氨酸Glycine、谷氨酸Glutamic acid、谷氨酰胺Glutamine、天冬氨酸Aspartic acid、脯氨酸Proline、絲氨酸Serine、羥脯氨酸Hydroxyproline、酪氨酸Tyrosine、瓜氨酸Citrulline、精氨酸Arginine、半胱氨酸Cysteine 等非必需氨基酸。

3 討論

腸道是生物體營養物質吸收與代謝發生的重要場所，腸道微生物在促進腸道行使生理功能的過程中發揮了關鍵作用[28]。通過分子水平的研究發現，腸道微生物的種類及豐度會與宿主的食性和健康相互作用[29]。水生動物腸道微生物組成受到多方面因素影響，例如生存環境、物種類別、食物來源、養殖模式、發育階段等都可能使宿主腸道微生物的組成產生差異，甚至對優勢菌群的種類產生影響。龜足與其他水生動物的腸道微生物組成種類相似，優勢菌群為變形菌門、擬桿菌門等，但結構比例有較大差異，如赤眼鱒腸道菌群在門水平上的優勢菌群為放線菌門、厚壁菌門等[30]，長江口日本鰻鱺幼體腸道微生物菌群以變形菌門和擬桿菌門為主要優勢菌門[31]，中華絨螯蟹的腸道優勢菌群為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門[32]，蝦類的腸道微生物優勢菌群為變形菌門、放線菌門和厚壁菌門等[33?35]。

生物體腸道微生物種類受到生存環境和食物的影響。食物種類可以明顯影響甲殼類動物的消化酶活力，消化酶活力水平的高低直接反映了生物體對攝入食物中營養成分的利用能力[36?37]，林崗等[38]對采自福建省連江縣定海海區龜足的5 種消化酶的酶活力進行了測定，結果表明，其中酶活力最高的為類胰蛋白酶，胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力均為較高水平，活力極低的為纖維素酶，這與龜足在野外生存環境中春夏季食譜中橈足類、無節幼體等動物性食物較為豐富有關。齊衍萍等[39]2005 年9 月和2006 年5 月對福建羅源灣浮游動物群落特征進行了調查，共鑒定到浮游動物70 種，浮游幼蟲20 類，其中浮游動物成體所屬門類中橈足類多達32 種，這些浮游類生物為龜足主要的食物來源，共同印證了龜足腸道微生物代謝組數據中脂類及類脂分子處于較高水平的結果。劉倩倩[40]對定海灣微食物網結構進行了研究，結果表明不同養殖時期的浮游細菌中的優勢類群均為變形菌門、放線菌門、藍藻門和擬桿菌門，這與龜足腸道微生物測序結果基本吻合。在對鮑魚腸道微生物的研究中發現，腸道菌群的變化與鮑魚飲食的變化相吻合[41]。高通量測序及代謝組學分析顯示，在刺參飼料中添加一定量的鼠李糖乳桿菌可以通過調控一系列代謝通路對刺參腸道微生物組成造成顯著影響[42]，表明餌料中的營養組成可改變宿主腸道微生物的結構。這解釋了龜足腸道微生物種類會受到其生存環境及食物的影響。

在樣品的功能預測方面，龜足腸道微生物氨基酸代謝、碳水化合物代謝和輔助因子、維生素代謝途徑較為旺盛，這些過程與蛋白質的合成與加工、新陳代謝等重要生理生化過程緊密相關，經過腸道微生物的加工能夠為龜足提供可直接利用的代謝底物[43]，對龜足生長發育起到重要作用。赤眼鱒[30]、日本鰻鱺玻璃鰻[31，44]、納木錯裸鯉[45]腸道微生物功能預測的研究結果也具有一定的相似性。

綜上所述，可以在明確龜足腸道微生物的組成、功能及其與生存環境關系的基礎上通過改善養殖環境、調整餌料配比、針對性飼料開發等方式改善龜足腸道微生物群落結構，在人工養殖條件下提供更適宜的生長環境，提高成活率及飼料營養轉化率，縮短養殖周期，實現快速人工育成。

4 結論

本文通過對龜足腸道樣品的相關研究發現龜足腸道微生物在門水平、綱水平、屬水平的最優勢菌分別為變形菌門Proteobacteria、擬桿菌綱Bacteroidia、沉積物桿狀菌屬Sediminibacterium。KEGG 代謝通路分析表明，龜足腸道微生物排名前3 的二級功能為氨基酸代謝（ Amino acidmetabolism）、碳水化合物代謝（ Carbohydratemetabolism）、輔助因子和維生素代謝（Metabolismof cofactors and vitamins）， 分別占比13.48%、12.94%、12.58%；龜足腸道微生物代謝產物在二級分類水平上共檢測到13 類，排名前三的為脂類和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機雜環化合物，分別占比31%、23%、15%；氨基酸排名前3的種類為甘氨酸、賴氨酸、谷氨酸。結果可為龜足營養學研究奠定基礎，也為龜足人工養殖及餌料開發提供一定參考。

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（責任編輯：柯文輝）

基金項目：中央引導地方科技發展專項（2022L3010）。