紅曲糟ACE 抑制肽制備工藝優(yōu)化及功能評價

摘 要：為研發(fā)紅曲糟血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin I-converting enzyme， ACE）抑制肽提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。以紅曲糟為原料制備ACE 抑制肽，明確活性肽序列和消化穩(wěn)定性。以單因素和正交試驗優(yōu)化ACE 抑制肽制備工藝，以超濾進行分離純化ACE 抑制肽，以質(zhì)譜分析活性肽的序列結(jié)構(gòu)，并采用模擬胃腸消化分析體外消化穩(wěn)定性。結(jié)果表明：紅曲糟ACE 抑制肽最佳制備工藝為酶添加量6 000 U·g?1、酶解時間90 min、溫度45℃、pH 值5.7，在此條件下紅曲糟蛋白的酶解率為（45.11±0.12） %；蛋白濃度為2.7 mg·mL?1 時，ACE 抑制率為（60.49±1.70） %；主要由分子量小于3 000 Da 的短肽組成。將酶解產(chǎn)物進行超濾，＜1 000 Da 的組分具有較高的ACE 抑制活性， 抑制率為（ 70.65±1.51） %； 生物活性值≥0.5 的潛在生物活性肽占比達48.22%。ACE 抑制肽＜1 000 Da 的組分經(jīng)模擬胃腸消化后，ACE 抑制活性保持率為58.94%。研究利用木瓜蛋白酶制備紅曲糟ACE 抑制肽，為降血壓功能食品配料的開發(fā)和釀酒副產(chǎn)物的高值化利用提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紅曲糟；ACE 抑制肽；結(jié)構(gòu)；消化穩(wěn)定性

中圖分類號：TS201 文獻標志碼：A 文章編號：0253?2301（2024）11?0001?08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.11.001

紅曲黃酒是福建省重要的釀造酒。經(jīng)調(diào)研，2014 年生產(chǎn)能力12.50 萬t，由此產(chǎn)生紅曲黃酒糟2.5 萬t 以上。目前，大量的紅曲黃酒糟只是被簡單加工成低值飼料或直接丟棄，不僅造成經(jīng)濟損失，也給環(huán)境帶來了嚴重污染[1]。如何高效利用黃酒糟，開發(fā)優(yōu)質(zhì)的功能營養(yǎng)食品，提高產(chǎn)品的附加值，具有重要的現(xiàn)實意義。紅曲糟含淀粉、糖、蛋白質(zhì)、纖維素等，干燥紅曲糟蛋白質(zhì)可達40%～50%[2]。而紅曲糟蛋白主要為大米蛋白，具有低抗原性，不含致敏因子[3]。Izawa 等[4]、洪智勇等[5]研究表明紅曲糟具有高效的抗癌功能。通過酶解技術(shù)，酒糟蛋白可降解為小分子肽類，具有抗氧化、降血壓、抗菌、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[6?7]，具有良好的應(yīng)用前景。

隨著我國經(jīng)濟社會的發(fā)展，高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病已成為我國發(fā)病率和死亡率占據(jù)首位的疾病，嚴重威脅居民身體健康[8]。在心血管疾病早期階段， 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（ renin-angiolensin-aldosterone system， RAAS） 對血壓的慢性調(diào)節(jié)具有重要作用[9?10]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是該系統(tǒng)調(diào)節(jié)血壓的關(guān)鍵酶。替普羅肽、卡托普利等化學合成藥物對高血壓具有良好的治療效果，但往往也具有一定的副作用，如蛋白尿、白細胞減少、皮疹等。食源性的ACE 抑制肽以其溫和、安全、易吸收等特點成為近年高血壓控制藥物研究的熱點[11?12]。越來越多的科研人員從大豆、芝麻、小麥、玉米、畜肉、魚肉等動植物、海洋生物原料中分離出具有降血壓功能的活性肽[13]。本研究以福建特色釀造酒下腳料紅曲黃酒糟為原料，通過單因素試驗和正交試驗對酶添加量、酶解溫度、時間和pH 等酶解工藝參數(shù)進行優(yōu)化，并對其進行分離純化和序列鑒定，以期待為酒糟資源的高值開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

紅曲糟購于福建藍溪紅酒業(yè)有限公司，60℃ 烘干超微粉碎后備用，蛋白質(zhì)含量42.16%，含水量6.5%。紅曲酒糟蛋白以紅曲糟為原料，通過70% 乙醇料液比1∶10 清洗2 次，以低溫α-淀粉酶于pH 6.0、溫度45℃ 酶解4 h，離心后收集沉淀，60℃ 烘干后進行超微粉碎。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶購自江蘇銳陽生物科技有限公司；胰蛋白酶購自賽默飛世爾科技公司。其他試劑均為分析級。

1.1.2 設(shè)備

ZDJ-400H 滴定儀（北京先驅(qū)威鋒有限公司）；Himac CR22N 型高速冷凍離心機（日本日立株式會社）；UH5300 紫外可見分光光度計（日本日立有限公司）； SH420 型石墨消解儀（海能未來技術(shù)集團股份有限公司）；K9840 型半自動凱氏定氮儀（海能未來技術(shù)集團股份有限公司）；全波長酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；waters e2695 型高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司）。

1.2 ACE 抑制肽的制備

取紅曲糟蛋白， 按照紅曲糟蛋白∶水=1∶10（m/m）比例加水，采用前期篩選的木瓜蛋白酶[14]，以酶解率和ACE 抑制率為指標，以酶添加量、溫度、pH 和酶解時間進行單因素試驗，并通過正交試驗優(yōu)化酶解工藝。以沸水浴10 min 滅酶，4℃10 000 g 離心15 min，收集上清液。

1.2.1 單因素試驗

（1）酶添加量：取紅曲糟蛋白， 酶添加量分別設(shè)為3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U·g?1，酶解pH 7，溫度50℃，時間4 h。（2）溫度：取紅曲糟蛋白，酶解溫度分別設(shè)為40、45、50、55、60℃，酶添加量5 000 U·g?1，酶解pH 7，時間4 h。（3）酶解時間：取紅曲糟蛋白，以復合蛋白酶酶解，時間分別設(shè)為2、3、4、5、6 h，酶添加量5 000 U·g?1，溫度50℃，酶解pH 7。（4）pH：取紅曲糟蛋白，以復合蛋白酶酶解，酶解pH 值分別設(shè)為5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8，加酶量5 000 U·g?1，溫度50℃，時間4 h。

1.2.2 正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，通過三因素三水平正交試驗優(yōu)化酶解工藝，見表1。

1.3 ACE 抑制肽的分離

選取截留分子量為1 000 Da 和3 000 Da 的超濾膜對樣品進行超濾，得到不同分子量的活性肽（＜1 000 Da 和1 000～3 000 Da），進行ACE 抑制活性分析。

1.4 檢測方法

1.4.1 蛋白含量

參照GB 5009.5?2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱氏定氮法測定蛋白含量。

1.4.2 酶解率

參照張國治等[15]方法測定酸溶性蛋白含量，計算酶解率。

式中，X 為酶解率（%）；X1 為酶解后酸溶性蛋白含量（%）；X2 為酶解前蛋白質(zhì)含量（%）；X0 為酶解前酸溶性蛋白含量（%）；M1 為原料質(zhì)量（g），M2 為酶解后上清液質(zhì)量（g）。

1.4.3 ACE 抑制率

參照李偉偉等[16]方法，并配置肽濃度為0.27 mg·mL?1，測定ACE 抑制率。

式中，Z 為ACE 抑制率（%），Ma 為對照組馬尿酸生成量（μg·mL?1）；Co 為試驗組馬尿酸生成量（μg·mL?1）。

1.4.4 相對分子質(zhì)量分布和游離氨基酸組成

參考GB/T 22492?2008《大豆肽粉》中所列方法測定相對分子質(zhì)量分布和游離氨基酸組成。

1.4.5 質(zhì)譜分析

參考石嘉懌等[3]方法，經(jīng)10 000Da 超濾，使用C18 除鹽柱進行脫鹽處理后，采用Q Exactive LC-MSMS 高分辨質(zhì)譜儀（ ThermoScientific，Waltham，MA，USA）進行序列鑒定。采用PEAKS Studio 8.5（ Bioinformatics SolutionsInc.Waterloo，Canada）軟件進行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析，數(shù)據(jù)庫為Uniprot-Oryza sativa 物種蛋白和Uniprot-Glutelin 數(shù)據(jù)庫。

1.4.6 體外消化穩(wěn)定性

參考張佩等[17]配置模擬胃液和模擬腸液，構(gòu)建體外消化系統(tǒng)。將ACE 抑制肽溶解于模擬胃液中，37℃ 消化2 h，滅酶后測定ACE 抑制活性。取胃液樣品，調(diào)節(jié)pH 至6.8，加入等體積模擬腸液，37℃ 消化4 h，滅酶后測定ACE 抑制活性。

1.5 統(tǒng)計分析

各組試驗數(shù)據(jù)均重復3 次， 試驗數(shù)據(jù)采用Origin 2019b 軟件和SPSS 15.0 軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析和圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE 抑制肽的制備

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

利用木瓜蛋白酶對紅曲糟蛋白進行酶解，以酶解率和ACE 抑制率為指標，分別以酶添加量、溫度、pH 和時間進行單因素試驗。由圖1A 可知，隨著酶添加量的增加，紅曲糟蛋白酶解率和抑制率均呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢。由此可知，增加酶添加量可提高酶解率和酶解液的ACE 抑制活性[18]。酶添加量為6 000 U·g?1 時，酶解率和抑制率最高，分別為（42.44±0.51） % 和（64.20±2.72） %。由圖1B 和圖1C 可知，隨著溫度和pH 的增加，酶解率和抑制率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在溫度單因素試驗中，酶解溫度為45℃時，酶解率和抑制率達到最大值，分別為（41.08±0.89） % 和（59.21±0.41） %。pH 改變底物與蛋白酶的電荷分布， 影響底物和酶的結(jié)合。當pH6.0 時，酶解率為（37.83±0.24） %，抑制率達到最高值（55.62±1.77） %；當pH 7.0 時，酶解率達到最高值（ 40.83±0.24） %， 抑制率為（ 44.04±0.98） %。這表明，通過pH 改變酶的空間結(jié)構(gòu)可以調(diào)控酶切位點，從而獲得不同活性的酶解產(chǎn)物。由圖1D 可知，隨著酶解時間的延長，蛋白酶解率呈現(xiàn)逐漸上升后趨于平緩的趨勢，抑制率則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當酶解時間為2 h 時，酶解率為（36.70±0.98） %，抑制率達到最大值（63.80±2.23） %；當酶解時間為4 h 時，酶解率達到最高值（ 40.66±0.83） %， 抑制率為（ 47.53±0.5） %。以抑制率為指標，較佳的pH 和時間分別為6.0 和2 h。值得注意的是，在pH 和時間的單因素試驗中，酶解率和抑制率的最高值并不同時出現(xiàn)，隨著酶解率的進一步上升，抑制率都出現(xiàn)了下降趨勢，這可能是因為，活性肽被進一步酶解產(chǎn)生了更多的小分子寡肽或氨基酸，肽活性結(jié)構(gòu)域被瓦解，從而降低了酶解液的抑制活性[19]。

2.1.2 正交試驗結(jié)果

由表2、表3 可知，紅曲糟ACE 抑制肽制備的各因素對 ACE 抑制率的影響主次順序為A＞B＞C，即時間＞溫度＞pH，時間和溫度對抑制率的影響達極顯著水平（P＜0.01）。酶解的最適條件為：A1B2C1，即酶解時間90 min，溫度45℃，pH 值5.7。對最優(yōu)組合條件下進行2次重復試驗， 酶解率分別為44.99% 和45.23%，平均值為45.11%；抑制率分別為58.79% 和62.19%，平均值60.49%。

2.2 ACE 抑制肽的相對分子量分布

由圖2 可知，ACE 抑制肽主要由分子量小于3 000 Da 的短肽組成，占總肽的97.4%；游離氨基酸總和占總肽的4.92%，說明主要由2～15 個氨基酸的寡肽組成[20]。據(jù)報道，分子量小于3 000 Da的肽組分具有較好的抑制效果[21]。因此，本研究采用超濾膜對樣品進行純化，并對分子量小于3 000Da 的組分進一步分離并分析活性。

2.3 ACE 抑制肽的分離及活性分析

取截留分子量為3 000 Da 的超濾膜對樣品進行超濾，對得到的小于3 000 Da 的組分，進一步超濾分離，得到不同分子量的活性肽：＜1 000 Da和1 000 ～3 000 Da，進行ACE 抑制活性分析，抑制率分別為（70.65±1.51） % 和（24.24±1.13） %。＜1 000 Da 的組分ACE 抑制活性顯著高于1 000～3 000 Da 的組分，與華鑫等[21]研究結(jié)果相符。因此，本試驗選擇＜1 000 Da 的組分進行質(zhì)譜分析。

2.4 ACE 抑制肽的質(zhì)譜分析

采用質(zhì)譜對＜1 000 Da 的組分進行分析，共鑒定出4 361 條肽序列。通過Peptide Ranker 程序（ http：//distttilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/） 篩選出生物活性值≥0.5 的潛在生物活性肽共有2 103條，占比48.22%，其中長度小于10 肽的肽段共有1 800條，占比41.27%。生物活性值前20 的肽序列見表4。肽鏈中疏水氨基酸與芳香族氨基酸的含量與ACE 抑制活性呈正相關(guān)，尤其是疏水性氨基酸的存在，使其更有利于與ACE 活性位置親和[22]，疏水氨基酸占比50% 以上的肽段共17 條， 符合ACE 抑制肽的特點[23]。當C-端氨基酸有芳香族氨基酸（ W、Y、F）、脂肪族氨基酸（ I、A、L、M），有利于活性肽與ACE 活性位點相結(jié)合。當?shù)箶?shù)第2 個氨基酸為脂肪族氨基酸（V、I、A）、堿性氨基酸（K、R、H）和芳香族氨基酸（Y、F），同時N-端為疏水性氨基酸（G、A、V、L、I、P、F）或堿性氨基酸（K、R、H）時，活性肽具有更強的ACE 抑制活性[24]。此20 條肽段中，17 條肽段C 末端為芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸，5 條肽段倒數(shù)第2 個氨基酸為堿性氨基酸或芳香族氨基酸，13 條肽段N-端為疏水性氨基酸，與ACE 的結(jié)合能力強，具有更好的降壓效果。

2.5 體外消化穩(wěn)定性分析

消化類的蛋白酶可進一步降解活性肽，生成小分子寡肽或游離氨基酸，使抑制肽的活性降低[25]。利用模擬胃腸液評價紅曲糟ACE 抑制肽的體外消化穩(wěn)定性。經(jīng)模擬胃液消化后， 抑制率由（70.65±1.51） % 降低至（55.84±0.80） %，經(jīng)模擬腸液進一步消化后， 最終產(chǎn)物的抑制率為（43.32±1.72） %。這表明，胃腸道消化酶使部分肽鍵斷裂，降解了ACE 抑制肽，從而降低了肽的抑制活性，這一研究結(jié)果與常暢等[26]研究相符。據(jù)報道，活性肽的疏水性、酸堿性和C、N 末端氨基酸的類型等特性都可能影響肽的胃腸道消化穩(wěn)定性[27]。質(zhì)譜分析表明，紅曲糟ACE 抑制肽的疏水氨基酸占比高，C、N 末端多為芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸和疏水性氨基酸，從而降低了肽的消化穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

紅曲糟富含豐富的生物活性成分，不僅具備顯著的降脂、降糖作用，同時也表現(xiàn)出較強的抗菌、抗炎癥等多種生物活性作用。但目前，酒糟的研究主要仍集中于調(diào)味品的研制和抗氧化肽的提取純化[28?30]，酒糟作為發(fā)酵副產(chǎn)物，其蛋白的功能性研究在國內(nèi)外鮮有報道。活性肽作為一類具有特定健康益處的蛋白質(zhì)片段，在原始蛋白序列中不表現(xiàn)活性，通過消化或特定的食品加工被釋放出來，從而展現(xiàn)出多樣的生物活性[31]。課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn)，以紅曲糟蛋白酶解釋放的多肽，具有高效的ACE 抑制活性。以紅曲糟制備ACE 抑制肽，為精準降壓健康食品或特殊繕食食品開發(fā)提供依據(jù)，具有巨大的市場潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

市場上常規(guī)蛋白酶有堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶等等。這些蛋白酶通常呈現(xiàn)出特有偏好性。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一種低特異性蛋白水解酶，具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點[32]。在水解過程中，木瓜蛋白酶優(yōu)先斷裂疏水性氨基酸組成的肽鍵，水解產(chǎn)物通常呈現(xiàn)良好的風味，酶解制備的紅曲糟ACE 抑制肽具有較高的生物活性。李晶晶等[33]通過木瓜蛋白酶對扇貝裙邊進行酶解，獲得了高活性ACE 抑制肽，抑制率71.25%。在本試驗中，通過優(yōu)化酶解工藝，以木瓜蛋白酶制備紅曲糟ACE 抑制肽的最佳方案為：酶添加量6 000 U·g?1，酶解時間90 min，溫度45℃，pH 值5.7。在此條件下，酶解率為（45.11±0.12） %，ACE 抑制率為（60.49±1.70） %；主要由分子量小于3 000 Da 的短肽組成，占總肽的97.4%。通過比較不同分子量范圍的組分發(fā)現(xiàn)，＜1 000 Da 的組分具有較高的ACE 抑制活性，抑制率為（70.65±1.51） %。

ACE 是一種具有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。肽抑制劑的活性受其特定結(jié)構(gòu)特征影響，如肽鏈長度、親疏水性、氨基酸組成、序列組成和構(gòu)象等[34]。ACE 抑制作用機制主要為ACE 與抑制劑相互作用，形成特定的空間結(jié)構(gòu)復合物[35]。本試驗通過質(zhì)譜測序， 鑒定活性肽的氨基酸序列， 分析ACE 抑制特征的氨基酸活性位點，篩選出具有ACE 抑制功能活性位點的芳香族氨基酸和疏水性氨基酸序列。分析結(jié)果表明，生物活性值≥0.5 的潛在生物活性肽共占比48.22%。生物活性值前20 的肽序列中，17 條肽段疏水氨基酸占比50% 以上，C、N 末端多為芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸和疏水性氨基酸，具有潛在的高ACE 抑制活性。肽段的解析，為后期合成高效ACE 抑制肽段和進行細胞學生物活性驗證提供基礎(chǔ)支持。通過木瓜蛋白酶制備的紅曲糟ACE 抑制肽，經(jīng)模擬胃液消化后，活性保持率為75.07%；經(jīng)模擬腸液消化后，活性保持率為58.94%，具有良好的消化穩(wěn)定性。本研究為福建特色釀酒副產(chǎn)物紅曲糟制備ACE 抑制肽的高值化開發(fā)利用提供依據(jù)。

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（責任編輯：柯文輝）

基金項目：福建省科技計劃省屬公益類項目（2022R1032009、2024R1081）。

何志剛，1964 年生，二級研究員，享受國務(wù)院政府特殊津貼專家，福建省杰出科技人才，福建省百千萬工程領(lǐng)軍人才，福建省高層次B 類人才，現(xiàn)任福建省農(nóng)業(yè)科學院食品加工學科首席專家、福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室主任，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏、食品生物技術(shù)等領(lǐng)域的研究與開發(fā)工作。先后承擔或參加部、省級及院廳級的研究與開發(fā)項目70 多項；主持項目獲福建省科學技術(shù)獎二等獎2 項及三等獎3 項、福建省專利獎二等獎1 項，參加項目獲福建省科學技術(shù)獎一等獎和二等獎各1 項、福建省科學技術(shù)獎三等獎4 項；獲授權(quán)國家發(fā)明專利19 項、實用新型專利4 項，發(fā)表學術(shù)論文近100 篇。兼任福建省食品科學技術(shù)學會常務(wù)理事、福建省輕工業(yè)聯(lián)合會專家委員會專家、福建省食品安全專家?guī)鞂＜业取?/p>