枸杞提取物中玉米黃質(zhì)和葉黃素含量的高效液相測定方法

唐 瑗，康 瑤，於洪建，張東星

1.天津中醫(yī)藥大學 天津 301617；2.天津益倍生物科技集團有限公司 天津 300457

枸杞是一種傳統(tǒng)的藥食同源藥材［1］，尤其利于明目，俗稱“明眼子”，其主要活性成分枸杞色素和枸杞多糖［2］具有多種功效，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、神經(jīng)保護、護肝護眼、抗氧化［3-4］。枸杞色素主要由游離型類胡蘿卜素、類胡蘿卜素酯化衍生物和類胡蘿卜素糖基化衍生物組成［5］，游離類胡蘿卜素含有葉黃素、新黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)和隱黃質(zhì)等［6］。由于枸杞富含類胡蘿卜素，所以常被用于開發(fā)護眼健康食品，在年齡相關性眼病研究中，玉米黃質(zhì)和葉黃素代替β-胡蘿卜素成為明目的主要功效性成分［7］。因此，枸杞提取物中葉黃素和玉米黃質(zhì)分離檢測方法的開發(fā)，對于研發(fā)含有枸杞的明目健康食品具有重要意義。

葉黃素和玉米黃質(zhì)具有相同的分子式，即C40H56O2，屬于同分異構(gòu)體。目前，高效液相色譜法是葉黃素和玉米黃質(zhì)最常用的檢測方法，用于兩者分離的固定相也有多種選擇，如硅膠、C18、C30 等。在相關文獻中，有研究者運用正相硅膠色譜柱對葉黃素和玉米黃質(zhì)進行了分離檢測，二者都能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離［8-9］；還有研究者使用C30 色譜柱對葉黃素和玉米黃質(zhì)進行了分離檢測，二者皆可被鑒定［10-15］；此外，還有研究者運用C18 色譜柱對葉黃素和玉米黃質(zhì)進行了分離檢測［16-19］。但對于枸杞中葉黃素和玉米黃質(zhì)的分離檢測，更多使用C30 色譜柱，流動相的選擇也較為復雜，最常使用二氯甲烷和甲基叔丁基醚作為改性劑。雖然使用C30 色譜柱可以更好地分離葉黃素和玉米黃質(zhì)，但由于C30 柱價格更高，流動相毒性較大，不利于常規(guī)的普及性檢測。相比之下，C18 色譜柱是一種常用的固定相，使用C18 色譜柱來建立玉米黃質(zhì)與葉黃素同時快速測定方法對于枸杞提取物質(zhì)量控制具有重要意義。同時，該方法的建立有助于推廣和普及對葉黃素和玉米黃質(zhì)的快速測定技術，能夠促進具有明目功效的枸杞產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

枸杞提取物（批號：20221001、20221003、20221006、20220417），無錫市世紀生物有限公司；無水乙醇（分析純），天津市康科德科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），天津市康科德科技有限公司；玉米黃質(zhì)標準品（HPLC≥98%），北京倍特仁康生物醫(yī)藥科技有限公司；葉黃素標準品（HPLC ≥98%），北京倍特仁康生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀E2695，沃特世有限公司；超聲波清洗器（KQ-500V型），昆山市超聲儀器有限公司；臺式低速自動平衡離心機（TDZ4-WS），湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；旋渦混合器（GL-88B），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平（十萬分之一），Mettler-Toledo MS105DU；色譜柱，Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液的配制

精確稱取玉米黃質(zhì)和葉黃素標準品2 mg，分別置于100 mL的棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，并作為母液，分別移取標準儲備液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL置于10 mL的容量瓶中；用無水乙醇定容，分別得到不同濃度提取的玉米黃質(zhì)標準品溶液和葉黃素標準品溶液。

1.3.2 供試品溶液的配制

精確稱取樣品125 mg，置于離心管中，加入無水乙醇適量，用旋渦混合器振蕩，超聲10 min，以4 000 r/min離心10 min；重復上述操作至無色，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，將其作為供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

經(jīng)優(yōu)化，確定最佳色譜條件為：色譜柱，Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.05%三乙胺-乙腈；流速0.8 mL/min；檢測波長450 nm；柱溫28 ℃；進樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

玉米黃質(zhì)和葉黃素均易溶于有機溶劑，如甲醇、乙腈、無水乙醇、丙酮、二氯甲烷等［20］，故分別選用甲醇、乙腈、乙醇3種常用溶劑對葉黃素和玉米黃質(zhì)標準品進行溶解。葉黃素與玉米黃質(zhì)在甲醇或乙醇中的溶解度優(yōu)于乙腈，鑒于甲醇的毒性比乙醇大，且價格高于乙醇，相比之下，選擇毒性最小、價格低的乙醇作為提取溶劑。

2.2 流動相的選擇

在查閱參考文獻的基礎上，比較乙腈-甲醇［21-22］、乙腈和乙腈-二氯甲烷［23］3種流動相體系。在乙腈-甲醇流動相中，隨著乙腈比例的增加，出峰時間延長，葉黃素與玉米黃質(zhì)逐漸分離，但未實現(xiàn)基線分離；在乙腈-二氯甲烷（9:1）流動相中，葉黃素與玉米黃質(zhì)不能很好地分離；在乙腈流動相中，葉黃素和玉米黃質(zhì)的分離度良好，但隨著葉黃素和玉米黃質(zhì)濃度的增加，存在拖尾現(xiàn)象。故選擇純乙腈作為流動相，為改善拖尾現(xiàn)象，加入0.05%三乙胺，從而獲得良好的峰形與分離度。葉黃素、玉米黃質(zhì)及其混合標準色譜圖分別見圖1～3，樣品見圖4。

圖1 葉黃素標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of lutein standard

圖2 玉米黃質(zhì)標準品色譜圖Fig.2 Chromatogram of zeaxanthin standard

圖3 葉黃素和玉米黃質(zhì)標準品色譜圖（色譜柱Innoval ODS-2）Fig.3 Chromatogram of lutein and zeaxanthin standard

圖4 樣品色譜圖（色譜柱Innoval ODS-2）Fig.4 Chromatogram of sample

2.3 檢測波長的選擇

取葉黃素和玉米黃質(zhì)標準溶液分別于200～500 nm處進行波長掃描，結(jié)果見圖5 ~ 6，葉黃素于447 nm處有最大吸收峰，玉米黃質(zhì)于453 nm處有最大吸收峰，綜合掃描結(jié)果，選擇450 nm為高效液相色譜檢測的測定波長。

圖5 葉黃素光譜圖Fig.5 Spectrum of lutein

圖6 玉米黃質(zhì)光譜圖Fig.6 Spectrum of zeaxanthin

2.4 檢測方法驗證實驗

2.4.1 線性范圍和檢測限度

分別吸取1.3.1 中葉黃素和玉米黃質(zhì)對照品溶液10 μL，記錄峰面積，以濃度X為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，并進行回歸計算，獲得玉米黃質(zhì)的線性回歸方程：

葉黃素的線性回歸方程

其中：Y為峰面積；X為玉米黃質(zhì)/葉黃素質(zhì)量濃度，μg/mL。

結(jié)果表明，玉米黃質(zhì)和葉黃素分別在0.207～20.7 μg/mL和0.216～21.6 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。用無水乙醇將玉米黃質(zhì)和葉黃素標準品溶液稀釋至一定濃度，記錄儀器信噪比（S/N）值，根據(jù)S/N≥3 時為儀器檢出限，得出玉米黃質(zhì)的檢出限為0.027 μg/mL、葉黃素的檢出限為0.056 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗

精確吸取2.07 μg/mL 玉米黃質(zhì)對照品溶液、2.16 μg/mL葉黃素的對照品溶液各10 μL，按1.3.3 下色譜條件分別連續(xù)取樣6 次，記錄峰面積，得出玉米黃質(zhì)的RSD值為0.47%、葉黃素的RSD為0.62%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一批供試品溶液，按1.3.3 下色譜條件，分別于0、2、4、6、12、24 h記錄玉米黃質(zhì)和葉黃素的峰面積，得出玉米黃質(zhì)的RSD值為1.38%、葉黃素的RSD值為4.45%。結(jié)果表明，在室溫條件下，玉米黃質(zhì)和葉黃素放置24 h穩(wěn)定性最好，但考慮到兩者抗氧化性和在光照條件下不穩(wěn)定等因素，所以兩者應隨測隨配。

2.4.4 重復性試驗

取批號為20221004 的枸杞提取物6 份，按照上述溶液配制方法制備供試品溶液，在1.3.3 下的色譜條件取樣10 μL，記錄峰面積，利用標準曲線，測定葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量，得出葉黃素、玉米黃質(zhì)的RSD值分別為0.96%、0.73%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗

精確稱取已知含量的枸杞提取物6 份，每份約26 mg，分別加入20.7 μg/mL的玉米黃質(zhì)對照品溶液0.5 mL 和21.6 μg/mL 的葉黃素對照品溶液0.1 mL；按照上述溶液配制方法，制備供試品溶液，再按1.3.3下的色譜條件，計算回收率，得出玉米黃質(zhì)平均回收率為113.72%、RSD值為1.50%、葉黃素平均回收率為105.96%、RSD 值為3.78%，結(jié)果見表1 ~ 2，加標回收率結(jié)果符合分析要求，試驗結(jié)果準確可靠。

表1 玉米黃質(zhì)加樣回收率試驗考察結(jié)果Tab.1 Results of zeaxanthin spiked recovery test

表2 葉黃素加樣回收率試驗考察結(jié)果Tab.2 Results of lutein spiked recovery test

2.5 不同色譜柱的考察

選擇2 根載碳量不同的色譜柱，Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）與Durashell C18（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm），載碳量分別為14%、17%，在相同的流動相0.05%三乙胺-乙腈、相同的檢測條件下，得到結(jié)果見圖3（色譜柱Innoval ODS-2）、圖7（色譜柱Durashell C18（L）），均可實現(xiàn)基線分離。

圖7 葉黃素和玉米黃質(zhì)標準品色譜圖[色譜柱Durashell C18（L）]Fig.7 Chromatogram of lutein and zeaxanthin standard

2.6 樣品的含量測定

對4 批不同批號的枸杞提取物中玉米黃質(zhì)和葉黃素進行含量測定，結(jié)果見表3。

表3 不同批次枸杞提取物中玉米黃質(zhì)和葉黃素含量Tab.3 Contents of zeaxanthin and lutein in different batches of Lycium barbarum extract

3 結(jié) 語

本研究選用色譜柱Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.05%三乙胺-乙腈為流動相，建立了用高效液相快速準確檢測枸杞提取物中葉黃素和玉米黃質(zhì)的方法。此方法所用流動相簡單，葉黃素和玉米黃質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，且峰形良好無明顯拖尾。標準樣品和待測樣品的測定結(jié)果表明，在所取濃度范圍內(nèi)，葉黃素和玉米黃質(zhì)均具有良好的線性關系，重復性、回收率等均滿足分析要求。