Bta-miR-101對牛睪丸支持細胞增殖、凋亡及分泌的影響

虎巧燕,翟相欽,李一丹,韓家樂,雷初朝,黨瑞華

(西北農林科技大學動物科技學院,楊凌 712100)

成熟精子由精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSC)進行自我更新和分化產生,于睪丸內的精細管中進行,精細管中主要包含支持細胞和生殖細胞[1]。支持細胞(sertoli cell,SC)是不規則的圓錐形細胞,核仁突出,是曲精細管內維持細胞生存微環境的組成部分,具有多種生物學功能[2-3],主要通過為生殖細胞提供生理和營養支持來調節精子發生,使精子能夠持續產生,在精子發生過程中起著核心作用[4-5]。支持細胞是微環境中最重要的體細胞類型,是唯一與精子各階段直接相交的體細胞,在精子發生中支持和引導雄性生殖細胞的發育,是決定精子產生質量與數量的關鍵因素[6]。由于只有未成熟支持細胞才能進行增殖,因此成年牛睪丸組織中支持細胞的數量以及支持細胞對生殖細胞的支持能力是固定的,這就意味著性成熟前公牛睪丸支持細胞的增殖能力對其性成熟后的繁殖性能有著重要影響[7]。

miRNA是小的內源性非編碼RNA,約有22～27個核苷酸,廣泛存在于各種生物中,具有高度的保守性,可以調控與機體生長發育相關的多種過程[8-10]。每個miRNA有多個mRNA作為靶點,與此同時,每個mRNA也受到多個miRNA的調控,這也使得蛋白質的表達調控更具復雜性[11-12]。諸多研究表明,miRNA可以通過對雄性睪丸支持細胞的增殖、凋亡、分泌以及血睪屏障的形成等過程進行調控,從而影響雄性動物的生殖能力[13-15]。Gao等[16]發現,miR-146b在牛睪丸組織中高表達,用miR-146b的mimics對生殖細胞進行處理后發現miR-146b會抑制生殖細胞的增殖,并促進其凋亡。2020年Sellem等[17]通過深度測序鑒定出了20余種在公牛睪丸組織中高表達的miRNA。Wu等[18]發現,miR-19b、miR-133a、miR-2285b、miR-2405、miR-759、miR-2284z、miR-34b、miR-2334、miR-2285e、miR-302a在青年公牛精液中的表達存在顯著差異,這些miRNA的靶點與著床前胚胎的代謝和發育通路如TGF-β、PI3K/AKT以及氧化磷酸化和線粒體功能障礙有關。因此,miRNA在雄性動物精子發生、支持細胞形成的過程中發揮著重要作用。

目前,關于miR-101的研究主要聚焦于對腫瘤及癌細胞的研究[19-20]。Dong等[21]發現,miR-101-3p通過抑制KPNA2促進細胞凋亡,從而抑制肺鱗狀細胞癌的活力、侵襲和遷移。在肝癌細胞中,Xu等[22]發現miR-101-3p靶向ARHGAP1抑制肝癌細胞集落的形成和侵襲。然而關于miR-101在生殖細胞方面,尤其是與支持細胞相關的研究相對較少。Luo等[23]研究了miR-101對豬卵母細胞的影響,發現miR-101通過靶向豬卵丘細胞中的HAS2來調控卵母細胞的成熟。程鵬等[24]研究發現,在隱睪小鼠個體中miR-101的表達量升高,說明miR-101與精子發生有著密切關系。實驗室前期轉錄組測序結果顯示,bta-miR-101在牛睪丸組織初生期和成年期的表達水平存在顯著性差異,初生期bta-miR-101的表達量高于成年期,因此推測miR-101可能對公牛的睪丸發育、精子發生以及繁殖性能有重要影響。本試驗以miR-101為研究對象,初步探索其對牛睪丸支持細胞增殖、分泌與凋亡的影響,為進一步研究miR-101對牛睪丸發育的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗主要試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清FBS(Cellmax,美國)、細胞裂解液(Solarbio,中國)、全蛋白提取試劑盒(索萊寶,北京)、ECL顯色液(索萊寶,北京)、PrimeScriptTM RT Master Mix、MiR-XTM miRNA FirstStrand Synthesis(TaKaRa,中國)、CCK-8、RNAiso(TaKaRa,中國)。miR-101 mimics、miR-101 inhibitor、mimics NC、inhibitor NC由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2 支持細胞采集與細胞培養及轉染

采集初生期(3日齡,n=3)和性成熟期(13月齡,n=3)安格斯牛新鮮的睪丸組織(采自于陜西秦寶牧業有限公司)及其小腸、肝、腎臟、肌肉、心臟、脂肪、肺等組織,用無菌的剪刀剪下組織放到做好標記相應的無菌凍存管中。快速置于液氮中,運回實驗室-80 ℃保存。試驗所用牛睪丸原代支持細胞由本實驗室分離純化。提交bta-miR-101成熟序列UACAGUACUGUGAUAACUGAA于上海吉瑪制藥技術有限公司合成miR-101 mimics、miR-101 mimics NC、miR-101 inhibitor、miR-101 inhibitor NC。SC培養于DMEM/F12培養基中,補充10%胎牛血清,置于細胞培養箱中37 ℃、5% CO2的條件培養。將miR-101 mimics、miR-101 mimics NC、miR-101 inhibitor、miR-101 inhibitor NC(序列見表1)分別轉染至SC中,每組3個重復,細胞轉染根據制造商說明書:5 μL miR-101 mimics/NC、inhibitor/NC(100 nmol·L-1)或EndoFectinTMMax轉染試劑用Opti-DMEM分別稀釋至150 μL,室溫靜置5 min。將稀釋的miR-101 mimics/NC或inhibitor/NC溶液以及EndoFectinTMMax溶液輕柔混合,室溫靜置20 min,向6孔板中逐滴添加RNA-EndoFectinTM復合物,在CO2培養箱中37 ℃孵育24～48 h。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 bta-miR-101的生物信息學分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及miRBase(http://www.mirbase.org/)數據庫查找各物種miR-101的成熟序列。利用在線工具TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://www.mirdb.org/index.html)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/.)和miRTarBase(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)分別對miR-101進行靶基因預測,將數據進行分析整理,利用在線工具KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)對靶基因進行Gene Ontology(GO)和KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析。

1.4 CCK-8檢測

利用CCK-8檢測細胞活性,將SC培養于96孔板中并進行轉染(1×104個·孔-1),轉染后置于CO2培養箱中培養48 h,設置6個重復。每孔加入10 μL的CCK-8試劑,置于CO2細胞培養箱中繼續孵育2 h。隨后使用酶標儀檢測混合物在450 nm處的吸光度,計算細胞增殖活力。

1.5 RT-qPCR檢測基因表達

利用RNAiso試劑處理SC并從中提取總RNA,使用Nanodrop1000測定RNA的純度和濃度。使用去基因組反轉錄試劑盒(TaKaRa,大連)在無RNA酶的條件下進行反轉錄合成cDNA。根據DiNing公司的2×Fast qPCR Master Mixture(Green)試劑盒進行PCR檢測,反應體系為:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL,Forward Primer 0.2 μL,Reverse Primer 0.2 μL,cDNA 1.0 μL,ddH2O 3.6 μL。反應條件:預變性:95 ℃ 30 s;40個循環:95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s;熔解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。相對表達量計算方法為2-ΔΔCT,其中分別以U6和β-actin做內參。RT-qPCR均為4個重復,所用引物序列見表1。

1.6 Western Blotting檢測蛋白水平

細胞轉染后36 h,利用全蛋白提取試劑盒(索萊寶,北京)提取細胞總蛋白。利用12% SDS PAGE凝膠將總蛋白提取液進行分離,并印跡在硝化纖維素膜上。將膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h,結束后將膜與一抗4 ℃過夜孵育,隨后二抗孵育2 h,將膜置于顯色板并滴上ECL顯色液(索萊寶,北京),利用ChemiDoc XRS+system(Bio-Rad,Hercules,USA)成像儀顯影。Image J軟件分析蛋白灰度。

1.7 統計分析

試驗結果通過數據分析軟件GraphPad Prism 9.0做柱狀圖分析。結果表示方式為“平均值±標準差(SD)”,每個試驗至少設置3個生物學重復。結果采用SPSS 19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進行分析,對于兩組結果的分析,使用獨立樣本t檢驗分析試驗結果的顯著性;對于兩組以上結果的比較,使用單因素方差分析Turkey檢驗進行顯著性分析,*表示P<0.05即差異顯著,**表示P<0.01即差異極顯著。

2 結 果

2.1 miR-101生物信息學分析

在NCBI和miRBases數據庫中查找miR-101的種子序列為GUACUGU,發現miR-101的成熟序列在哺乳動物中具有高度的保守性(圖1A)。利用4種在線軟件TargetScan、miRDB、miRWalk和miRTarBase分別預測到896、1 063、2 096、357個miR-101的靶基因,并使用Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)對預測結果進行交互繪制,共篩選出26個共同靶基因,如圖1B。對共同靶基因進行GO和KEGG富集分析,結果顯示這些靶基因主要富集在核質、蛋白質結合、JAK-STAT的受體信號通路上(圖1C),這些信號通路與細胞分化、細胞周期、細胞凋亡等生物過程有著密切聯系。

A.不同物種miR-101成熟序列;B.miRNA預測靶基因的韋恩圖;C.GO和KEGG富集分析A.Mature sequences of miR-101 in different species;B. Venn diagram of predicted target genes of miRNA;C. GO and KEGG enrichment analysis

2.2 bta-miR-101在牛不同時期不同組織中的表達分析及轉染效率驗證

為了研究miR-101在安格斯牛不同時期各種組織(心、肝、肺、腎、小腸、肌肉和睪丸)中的表達特征,提取了各組織中的RNA,利用RT-qPCR檢測bta-miR-101在各組織中的表達量,分析數據顯示,miR-101主要在腎臟組織中表達量較高(圖2A、2B)。在睪丸組織中,miR-101在初生期的表達量顯著高于性成熟期(P<0.01),與前期轉錄組測序結果一致[16],說明miR-101在牛睪丸組織中的表達具有階段特異性(圖2C)。將bta-miR-101的模擬物和抑制物轉染至牛未成熟睪丸支持細胞中,利用RT-qPCR檢測轉染后miR-101的表達量。結果顯示,與NC組相比較,用miR-101 mimics處理細胞后miR-101的表達量顯著上升(P<0.01),用miR-101 inhibitor處理細胞后miR-101表達量顯著下降(P<0.05),說明具有較高的轉染效率,可用于后續試驗(圖2D)。

A.bta-miR-101在牛初生期不同組織中的相對表達水平;B. bta-miR-101在牛性成熟期不同組織中的相對表達水平;C. bta-miR-101在犢牛和成年牛睪丸組織中的相對表達水平;D. bta-miR-101模擬物與抑制物轉染效率檢測。*.P<0.05;**.P<0.01;ns.P>0.05,下同A.The relative expression levels of bta-miR-101 in different tissues of neonatal cattle;B. The relative expression levels of bta-miR-101 in different tissues of adult cattle;C. Relative expression levels of bta-miR-101 in testicular tissue in calves and adult cattle;D. Transfection efficiency detection of bta-miR-101 mimics and inhibitor. *.P<0.05; **.P<0.01;ns.P>0.05,the same as below

2.3 bta-miR-101對SC增殖的影響

為探究bta-miR-101對SC增殖的影響,提取轉染了mimics NC、miR-101 mimics和inhibitor NC、miR-101 inhibitor的牛睪丸支持細胞的總RNA以及蛋白質,利用RT-qPCR檢測與增殖相關基因的表達量,利用Western Blotting試驗檢測增殖相關基因蛋白水平的表達量。對結果進行分析顯示,在mRNA水平,miR-101 mimics可以顯著增加增殖標記基因PCNA和CyclinD1的表達量,并顯著抑制p21的表達量(圖3A,P<0.05),而miR-101 inhibitor則可以顯著抑制CDK2、PCNA、CyclinD1基因的表達并顯著促進p21基因的表達(圖3B,P<0.05)。在蛋白水平,miR-101 mimics極顯著增加CDK2、PCNA的表達(P<0.01),而miR-101 inhibitor則降低CDK2、PCNA蛋白表達水平(圖3 D,3E,3F)。采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況,結果分析顯示,過表達miR-101可以顯著升高支持細胞的增殖系數(P<0.05),而抑制miR-101的表達可以極顯著降低細胞增殖系數(圖3C,P<0.01)。綜上所述,bta-miR-101可以促進牛未成熟支持細胞的增殖。

2.4 bta-miR-101對SC凋亡的影響

為進一步研究bta-miR-101對牛睪丸支持細胞凋亡的影響,同樣利用RT-qPCR檢測與凋亡相關基因的表達量。試驗結果顯示,與NC組相比,miR-101 mimics可以顯著抑制凋亡標志基因Caspase3、Caspase9并顯著提高B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl2)的表達,而miR-101 inhibitor則與之相反(圖4A,4B,P<0.05)。Western Blotting試驗結果顯示過表達miR-101可以極顯著抑制Caspase9蛋白水平的表達量,而干擾miR-101可以促進Caspase9在蛋白水平的表達(圖4C,4 D,P<0.01)。以上結果說明bta-miR-101對牛睪丸支持細胞的凋亡具有抑制作用。

2.5 bta-miR-101對SC分泌的影響

合成并分泌可以調節精原細胞自我更新與分化的必須生長因子是睪丸支持細胞的重要功能之一。為了研究bta-miR-101對睪丸支持細胞分泌功能的影響,利用RT-qPCR檢測了與細胞分泌相關的標志基因的表達量,分析結果顯示過表達miR-101可以顯著促進GDNF、BMP4基因的表達,干擾miR-101則可以極顯著抑制以上基因的表達(圖5A,5B,P<0.05)。利用Western Blotting檢測由睪丸支持細胞合成并分泌的雄激素結合蛋白(ABP)的表達,結果顯示過表達或干擾miR-101對ABP的表達并無明顯作用(圖5C,5 D),說明bta-miR-101對睪丸支持細胞分泌標志基因的轉錄具有一定的促進作用,但對雄激素結合蛋白的分泌無顯著影響。

3 討 論

睪丸支持細胞是唯一與生殖細胞各階段直接接觸的體細胞,是微環境的組成部分,具有多種生物學功能,主要通過調節生殖細胞生理和營養支持來調節精子的發生。通過對初生期(3日齡)和性成熟期(13月齡)安格斯牛的睪丸組織進行轉錄組測序,鑒定出在這兩個時期差異表達的miR-101,并且與初生期安格斯牛睪丸組織中miR-101的表達量相比,性成熟期miR-101的表達量顯著下降,說明miR-101與牛睪丸組織的發育密切相關。本研究對初生期和性成熟期的安格斯牛構建了組織表達譜,對轉錄組測序結果進行了驗證,分析結果表明miR-101在牛初生期睪丸組織中的表達量處于較高的水平,在性成熟后顯著下調。除此之外還對miR-101的靶基因進行了預測以及GO和KEGG富集分析,結果顯示這些靶基因主要富集在核質、蛋白質結合、JAK-STAT的受體信號通路上。這些信號通路與細胞分化、細胞周期、細胞凋亡等生物過程有著密切聯系。因此,本試驗針對miR-101對牛睪丸支持細胞增殖、凋亡和分泌的影響進行了探究。

雄性動物中,在青春期前,睪丸支持細胞會分泌一種可以分解視黃酸的酶來抑制精原干細胞分化成為精子,從青春期開始,睪丸支持細胞便不再增殖發育[25],而是通過旁分泌的方式分泌調節因子調控精子的發生過程[26]。支持細胞的數量對可以分化成精子的生殖細胞有著決定作用,在一定程度上,青春期前形成的支持細胞數量與后期所能生成精子的數量成正比[27-28]。本研究結果顯示,miR-101對牛睪丸未成熟支持細胞的增殖具有促進作用,對其凋亡具有抑制作用。過表達或干擾miR-101會對與細胞增殖和凋亡相關基因在轉錄水平的表達造成顯著性影響(P<0.05)。在大多數真核生物中,細胞周期是一個受到多種基因調控的復雜動態過程,包含了多個協同事件[29-30]。其中有兩個最為重要的階段,即G1/S期和G2/M期,這兩個階段細胞內分子水平的變化活躍而復雜,非常容易受到環境的影響[31],而G1/S這一轉化期受到CDK2、PCNA、CyclinD1、p21等基因的密切調控[32-33],說明miR-101主要通過影響與細胞周期相關基因的表達來促進未成熟支持細胞的增殖。細胞凋亡是受到Bcl2家族、Caspase家族、癌基因與抑癌基因等多基因嚴格控制的過程。本研究結果顯示,miR-101可同時作用于Bcl2、Bax、Caspase9、Caspase3基因,引起其表達量發生變化,其中Caspase和Bcl2家族介導的兩個關于細胞凋亡的重要信號通路分別是死亡受體介導的外在信號通路與線粒體和內質網相關內在信號通路[34]。因此miR-101可能綜合作用于兩種凋亡途徑來調控牛未成熟睪丸支持細胞的凋亡。高振[35]研究發現,miR-432可能通過下調其靶基因REM1的表達,從而促進牛睪丸支持細胞的增殖和分泌功能,抑制其凋亡。經統計研究發現,miR-10b[36]、miR-3584-5p[37]、miR-1285[38]、miR-762[39]、miR-196a[40]、miR-133b[41]和miR-301b-3p[37]等可以促進支持細胞的增殖而抑制其凋亡,與本研究結果一致。綜上所述,miR-101在牛初生期高表達并促進牛未成熟睪丸支持細胞的增殖,抑制其凋亡,與睪丸支持細胞的發育規律相吻合,進一步印證了miR-101對睪丸支持細胞增殖、凋亡及分泌的調控作用。關于miR-101具體如何調控未成熟支持細胞增殖、凋亡、分泌等過程的途徑還需進一步的研究。

值得注意的是,目前關于miR-101的研究大部分集中于腫瘤細胞上,被認為是一種腫瘤抑制因子,已經被證實與多種癌癥的發生有著重要聯系,由此也說明miR-101在細胞的增殖、凋亡過程中確實發揮著重要作用[42-43]。在腫瘤細胞中,多數研究表明miR-101對腫瘤細胞的增殖有明顯的抑制作用。Zhang等[44]研究了miR-101對骨肉瘤的影響,發現其通過下調靶基因BCL6來抑制骨肉瘤細胞的增殖。Han等[45]發現,miR-101可以通過抑制IDH2的表達來升高α-KG濃度,并通過促進HIF1α羥基化降解下調其表達,從而抑制缺氧條件下的Warburg效應來減弱肺癌細胞的增殖。而本研究的結果顯示,miR-101對未成熟睪丸支持細胞具有促進增殖的作用,與其在大多數腫瘤細胞中的研究結果有所不同。Qu等[46]研究了miR-101對山羊毛囊干細胞增殖與凋亡的影響,結果顯示過表達miR-101可以顯著降低毛囊干細胞的凋亡并促進其增殖(P<0.01),這與本研究結果相一致。因此推測,造成這種很差異的原因可能是由于惡性腫瘤細胞相比正常細胞其分化程度、生長速度、生長方式等都已經發生了異變,亦或可能是由于物種或組織之間的差異引起miR-101對兩類細胞增殖、凋亡及分泌的影響有所不同,其具體機制還有待進一步探究。

4 結 論

本研究結果表明,miR-101上調增殖相關基因的表達促進牛未成熟支持細胞的增殖,并作用于兩條細胞凋亡的信號通路來抑制牛未成熟睪丸支持細胞的凋亡,對雄激素結合蛋白的分泌無顯著影響。表明miR-101在牛未成熟睪丸支持細胞的發育中具有重要的調控作用。