脯氨酸羥化酶(PHDs)對(duì)動(dòng)物骨骼肌發(fā)育和脂肪沉積的調(diào)控作用及其機(jī)制

梁淑怡,李 凡,江青艷,王松波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 廣東省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 優(yōu)百特脂立方功能性脂肪酸研究中心,廣州 510642)

骨骼肌和脂肪是動(dòng)物機(jī)體的主要組成部分,同時(shí),骨骼肌發(fā)育及脂肪沉積也會(huì)直接影響畜禽的產(chǎn)品品質(zhì)。動(dòng)物骨骼肌發(fā)育和脂肪沉積都是復(fù)雜且有序的生理過程。骨骼肌的大小主要由肌纖維的數(shù)量以及肌纖維的肥大決定,肌纖維的數(shù)量在動(dòng)物胚胎期就基本固定了,而肌纖維的肥大以及肌纖維的類型對(duì)畜禽的產(chǎn)肉性狀起著重要作用[1]。脂肪沉積主要通過脂肪細(xì)胞的數(shù)量增加和體積增大來實(shí)現(xiàn)[2]。骨骼肌發(fā)育和脂肪沉積過程受到多種因素的調(diào)節(jié),具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全明了。脯氨酸羥化酶(proline hydroxylases,PHDs)是一類非血紅素鐵依賴性雙加氧酶,可使靶蛋白的脯氨酸發(fā)生羥基化。近年的研究表明,PHD在肌肉發(fā)育和脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要作用,其可以通過調(diào)控血管生成、肌肉纖維化、脂質(zhì)代謝等多種生理過程,從而間接影響畜禽胴體品質(zhì)和肉品質(zhì)。

1 PHD的結(jié)構(gòu)與功能及活性調(diào)節(jié)

1.1 PHD的結(jié)構(gòu)與功能

脯氨酸羥化酶(proline hydroxylases,PHDs)作為一類非血紅素鐵依賴性雙加氧酶,是缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)信號(hào)通路的重要調(diào)控因子。此外,它還可以通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧適應(yīng)水平、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等方面,從而參與多種生理活動(dòng)的發(fā)生。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4個(gè)家族成員,分別是PHD1、PHD2、PHD3和PHD4,已有的研究大多涉及PHD1、PHD2和PHD3的生理功能,對(duì)PHD4的研究報(bào)道較少[3]。這幾種亞型的氨基酸序列相似性為42%～59%,在C末端結(jié)構(gòu)域具有較高的序列同源性,在N端有明顯不同[4]。因此,他們雖結(jié)構(gòu)相近,但也有不同。PHD2在氨基端具有一個(gè)PHD1和PHD3都不具備的特殊催化結(jié)構(gòu)——鋅指結(jié)構(gòu),這個(gè)結(jié)構(gòu)在線蟲EGL-9(egg laying-9)基因中也存在。并且編碼PHD1、2、3的基因與EGL-9基因同源[5-6]。可以推測(cè)PHD2與EGL-9的同源性更高,因此,PHD2具有和EGL-9蛋白相同的羥基化HIF蛋白的功能,且在PHDs家族中該成員生理活性最高。

PHDs在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)主要的生理功能為羥基化目標(biāo)蛋白的脯氨酸殘基,從而影響靶蛋白的穩(wěn)定性和功能。最典型的就是羥基化HIF-1α,其中活性最強(qiáng)的是PHD2,PHD3次之,PHD1活性最小[5]。HIF-1是由α和β亞基組成的異源二聚體,常氧條件下,PHDs以O(shè)2和α-酮戊二酸為底物,以Fe2+作為輔助因子,可以識(shí)別HIF-1α上第402位和第564位的脯氨酸殘基,使之發(fā)生羥基化,進(jìn)而經(jīng)希佩爾林道蛋白(von Hippel-lindau tumor suppressor protein,pVHL)介導(dǎo)而進(jìn)行泛素化降解。在缺氧條件下,PHDs羥基化活性下降,阻礙了HIF-1α的降解,使HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)并積累,從而激活下游靶基因,開啟相應(yīng)的表達(dá)調(diào)控,如圖1所示[7-9]。此外,PHDs還可以羥基化其他蛋白,例如PHD2可以羥基化UCP1的Pro-33,133,232位點(diǎn),以調(diào)控脂肪產(chǎn)熱等。

圖1 脯氨酸羥化酶的生理功能Fig.1 Physiological function of proline hydroxylase

圖2 PHD調(diào)控骨骼肌發(fā)育和脂肪沉積的可能機(jī)制Fig.2 Possible mechanisms of PHD regulating skeletal muscle development and fat deposition

1.2 影響PHD活性的因素

研究表明,PHDs的活性受氧分壓、鐵的螯合物、抗壞血酸、α-酮戊二酸、一氧化氮(NO)、胰島素、血管緊張素等多種因素的調(diào)節(jié)[9-11]。

PHD作為細(xì)胞氧感受器,活性受到氧氣濃度的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),在缺氧的條件下,PHD的活性下降,導(dǎo)致HIF-1α蛋白的累積,進(jìn)而激活HIF信號(hào)通路,而持續(xù)激活的HIF信號(hào)通路,又會(huì)通過負(fù)反饋?zhàn)饔谜{(diào)控PHD的表達(dá)[12]。此外,NO對(duì)PHD的活性也有一定調(diào)控作用。在常氧條件下,NO通過穩(wěn)定HIF來調(diào)節(jié)PHD活性[10]。

研究發(fā)現(xiàn),在網(wǎng)織紅細(xì)胞的裂解產(chǎn)物中,鐵含量越少,PHD的活性就越大。鐵與PHD之間的關(guān)聯(lián)復(fù)雜,具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究[13]。此外,一些二價(jià)金屬離子,如Co2+、Ni2+、Mn2+等,也可以抑制PHD的活性[14]。

α-酮戊二酸作為PHD發(fā)揮酶活性重要的輔助因子起著關(guān)鍵作用。α-酮戊二酸可被谷氨酰胺酶和谷氨酸脫氫酶催化,這些酶可以協(xié)調(diào)Fe2+的活性,導(dǎo)致底物的電子氧化,激活PHD下游基因。α-酮戊二酸的類似物,如甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalglycine,DMOG),可競(jìng)爭性抑制PHD的活性[10-11,15-16]。此外,三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物如延胡索酸、琥珀酸鹽、草酰乙酸等的積累也可以抑制PHD的活性[17]。

抗壞血酸在常氧條件下可以減少HIF-1α的積累,但在用α-酮戊二酸類似物阻斷PHD活性時(shí)其效果消失,這表明抗壞血酸與PHD活性有關(guān)[18]。

2 PHD對(duì)骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控作用及機(jī)制

骨骼肌是動(dòng)物體的重要組成部分,在調(diào)控機(jī)體運(yùn)動(dòng)和代謝穩(wěn)態(tài)方面起著非常重要的作用[19-20]。在畜禽生產(chǎn)當(dāng)中,骨骼肌的發(fā)育直接決定了畜禽產(chǎn)品的產(chǎn)量及品質(zhì)。動(dòng)物骨骼肌的生長是一個(gè)較為復(fù)雜的生理過程,在胚胎期骨骼肌生長主要體現(xiàn)在肌纖維的生成和數(shù)量增加,而動(dòng)物出生以后,骨骼肌的生長主要依靠肌纖維的肥大來實(shí)現(xiàn)[21]。動(dòng)物骨骼肌的生長受到不同的內(nèi)源性基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,此外,一些信號(hào)通路可以介導(dǎo)骨骼肌生長的調(diào)控,例如,Wnt信號(hào)通路[22]、PI3K-AKT信號(hào)通路[23]和HIF信號(hào)通路[24]等。

2.1 PHD對(duì)骨骼肌發(fā)育的調(diào)控

骨骼肌的發(fā)育涉及成肌細(xì)胞的增殖、分化和肌纖維的形成等。PHD各個(gè)亞型在骨骼肌以及在C2C12成肌細(xì)胞中均有表達(dá),并且,在C2C12分化的過程中,PHD3的表達(dá)水平增加[25]。成肌細(xì)胞培養(yǎng)過程中,氧分壓變化可以影響成肌細(xì)胞的增殖分化能力[24],而PHD的活性受氧分壓的調(diào)控。骨骼肌的形成主要由生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)協(xié)調(diào),包括肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyoG)、成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)、生肌因子5(myogenic factor 5,Myf5)和MRF4[26]。而據(jù)報(bào)道,PHD3可與這些調(diào)節(jié)因子相互作用[25],進(jìn)一步證實(shí)了PHD3對(duì)骨骼肌生長的調(diào)控作用。

在PHD1敲除的小鼠中,肌肉質(zhì)量減少[27]。PHD1敲除對(duì)亮氨酸的反應(yīng)顯示mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1)激活受損,mTORC1是一種重要的肌肉質(zhì)量調(diào)節(jié)器。PHD1促進(jìn)mTORC1活性的能力與其羥基化活性無關(guān)[28],而與亮氨酰tRNA合成酶(LRS)亮氨酸傳感器蛋白含量的降低有關(guān)[29]。PHD1在機(jī)制上與LRS相互作用并穩(wěn)定LRS。這種相互作用在氧和氨基酸消耗期間被促進(jìn),并保護(hù)LRS免于降解。

此外,有一些研究指出,PHD可以通過調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的密度參與調(diào)控肌纖維的生成。例如,PHD2缺失導(dǎo)致骨骼肌中肌纖維的轉(zhuǎn)化,并且在I型纖維的比例增加的區(qū)域,其毛細(xì)血管密度也增加[30]。在該團(tuán)隊(duì)的后續(xù)研究中,對(duì)小鼠進(jìn)行為期4周的跑步訓(xùn)練,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,PHD2骨骼肌特異性敲除不僅增加了毛細(xì)血管的數(shù)量,骨骼肌中每個(gè)區(qū)域的肌纖維數(shù)量也有所增加[31]。

PHD還可以影響骨骼肌代謝,例如,PHD3可以通過ACC2的羥基化介導(dǎo)骨骼肌組織中脂肪酸的氧化,從而影響肌肉的運(yùn)動(dòng)能力。在高能量條件下,ACC2羥基化可以抑制脂肪酸氧化[32]。PHD3缺失的小鼠骨骼肌中ACC2羥基化缺失,從而導(dǎo)致脂肪酸氧化升高。AMPK在許多細(xì)胞類型的低營養(yǎng)條件下都很活躍,在低葡萄糖條件下ACC2磷酸化增加[33],而在ACC2中觀察到的相反的羥基化則受AMPK負(fù)調(diào)控。ACC2物理結(jié)合PHD3[34],磷酸化ACC2會(huì)降低PHD3的活性。另外,PHD3可以介導(dǎo)AKG調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白轉(zhuǎn)換的過程,當(dāng)PHD3過表達(dá)時(shí),PHD3羥基化ADRB2,阻斷AKG在C2C12肌管中的抗蛋白降解作用[35]。PHD3還可以通過羥基化NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵因子來調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而抑制肌肉發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)合成[36]。

此外,本團(tuán)隊(duì)對(duì)豬不同骨骼肌組織中PHDs、骨骼肌生長相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),豬腰大肌中PHD3表達(dá)水平遠(yuǎn)高于背最長肌。骨骼肌生長基因的表達(dá)與PHD3水平呈負(fù)相關(guān),而骨骼肌蛋白質(zhì)降解基因的表達(dá)與PHD3水平呈正相關(guān)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。說明PHD3可能在豬骨骼肌生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用,提示PHDs可能參與肉品質(zhì)調(diào)控。

2.2 PHD對(duì)骨骼肌損傷和再生的調(diào)控

骨骼肌組織在肌外傷后具有很高的再生能力,機(jī)械性軟組織創(chuàng)傷有缺血性和炎癥性缺氧兩種,這表明HIF在肌外傷中有一定作用[37]。而PHD作為HIF通路的重要調(diào)控因子,對(duì)骨骼肌的再生可能存在一定影響。確有研究證明,PHD1和PHD3的敲除可以通過激活HIF-1α,促進(jìn)骨骼肌內(nèi)的血管生成,并改善缺血性的骨骼肌損傷和炎癥反應(yīng)[38-39]。PHD2缺失可增強(qiáng)小鼠軟組織創(chuàng)傷后骨骼肌組織的再生[40]。

而在PHD1敲除的小鼠中,PHD1氧傳感器的丟失會(huì)減少肌肉質(zhì)量[27]。此外,干擾PHD1或PHD3活性的小鼠表現(xiàn)出腓腸肌纖維化程度降低,并緩解缺血損傷后的肌肉質(zhì)量損失[39]。類似的,肌肉注射紅景天苷來抑制PHD3的轉(zhuǎn)錄活性,可激活骨骼肌細(xì)胞的旁分泌信號(hào),進(jìn)而激活骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的通訊,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的活性[38]。

肥胖會(huì)導(dǎo)致肌肉質(zhì)量下降和肌肉再生受損,據(jù)研究顯示,在肥胖狀態(tài)下病理性增加的PHD2會(huì)導(dǎo)致肌肉再生受損,同時(shí)觀察到血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)水平顯著下降,而在肥胖狀態(tài)下抑制PHD2活性可使肌肉恢復(fù)再生潛力[41]。

綜上所述,PHD缺失可以促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖分化、肌纖維類型轉(zhuǎn)化、肌纖維數(shù)量增加以及骨骼肌再生等,對(duì)骨骼肌生長發(fā)育起著重要調(diào)控作用。

3 PHD對(duì)脂肪沉積的調(diào)控作用及機(jī)制

脂肪組織是機(jī)體內(nèi)重要的能量存儲(chǔ)、內(nèi)分泌以及代謝器官,對(duì)于維持機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)和產(chǎn)熱供能具有重要作用。動(dòng)物體內(nèi)脂肪的沉積主要靠脂肪細(xì)胞數(shù)量增加、脂肪細(xì)胞肥大兩種途徑[42-43]。

3.1 PHD對(duì)脂肪生成與代謝的調(diào)控

PHDs可能是脂肪細(xì)胞的成脂分化以及脂肪代謝過程中重要的調(diào)控因子。

在對(duì)脂肪細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),在誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化過程中,PHD的3個(gè)亞型均有表達(dá)。PHD1在脂肪生成早期表達(dá),PHD2和PHD3則在脂肪生成晚期表達(dá)[44]。在脂肪生成的初始階段,抑制PHD的活性,會(huì)降低PHD的基因表達(dá),進(jìn)而阻斷脂肪細(xì)胞的形成[44]。還有研究探索了PHD在羅格列酮誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞分化期間所起的作用,發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞分化期間,3種PHD亞型在脂肪細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),而抑制PHD可使抗脂肪生成蛋白如GATA-3、KLF-2的水平增加[45]。以上結(jié)果說明,PHD可能參與調(diào)控脂肪的生成。

在活體上,有研究表明,不論是在普通日糧還是在高脂日糧飼喂的條件下,PHD2敲除的小鼠與野生型小鼠相比,脂肪組織減少,脂肪細(xì)胞也相對(duì)更小。PHD2敲除小鼠白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)中脂解標(biāo)記物L(fēng)ipe和Pnpla2的mRNA水平增加[46]。此外,PHD抑制劑也可導(dǎo)致肥胖癥小鼠WAT的質(zhì)量顯著降低,脂肪細(xì)胞大小減少,同時(shí)伴隨著血漿脂聯(lián)素的恢復(fù)以及脂質(zhì)代謝的改善[47]。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種具有生物活性的蛋白質(zhì),其表達(dá)水平與胰島素抵抗、肥胖和2型糖尿病呈負(fù)相關(guān)。有報(bào)道顯示,PHD是脂聯(lián)素產(chǎn)生和多聚化所必需的[48]。另外,PHD3缺失會(huì)激活促炎IKKβ/NF-κB信號(hào)通路,而減輕脂肪組織炎癥可以介導(dǎo)脂質(zhì)代謝的改善[47]。PHD3通過阻斷IKKβ的磷酸化來抑制NF-κB信號(hào),而這些磷酸化不依賴于羥基化。

此外,PHD可影響肝的脂肪沉積。缺氧影響肝脂質(zhì)代謝并擾亂肝脂質(zhì)積累,缺氧信號(hào)傳導(dǎo)也是脂肪組織功能障礙的關(guān)鍵,會(huì)導(dǎo)致脂肪組織纖維化、炎癥和胰島素抵抗。而PHD作為主要的細(xì)胞氧傳感器,自然也是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[49]。PHD1敲除小鼠在正常飼喂條件下肝的重量降低,肝組織脂肪變性和炎癥增加[50]。在PHD2或PHD3敲除的小鼠肝中,脂肪酸合成以及脂肪生成減少[46,51-52]。

本團(tuán)隊(duì)對(duì)豬不同脂肪組織中PHDs、脂肪沉積相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PHD2在豬不同脂肪組織中的表達(dá)存在差異,且與脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)呈正相關(guān)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。說明PHD2可能在豬脂肪沉積中發(fā)揮重要作用。

3.2 PHD對(duì)脂肪產(chǎn)熱的調(diào)控

目前,激活褐色脂肪產(chǎn)熱被認(rèn)為是減少肥胖的一種思路,通過激活脂肪產(chǎn)熱來減少脂肪的沉積。褐色脂肪組織是哺乳動(dòng)物體內(nèi)非顫栗產(chǎn)熱的主要來源,對(duì)于維持動(dòng)物的體溫和能量平衡起重要作用。解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)作為褐色脂肪產(chǎn)熱的標(biāo)志性蛋白,通過將氧化磷酸化與ATP合成解偶聯(lián),把底物氧化產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為熱能,以此促進(jìn)棕色脂肪產(chǎn)熱[53]。

而有研究表明,PHD2在褐色脂肪組織中的表達(dá)明顯高于在白色脂肪組織中的表達(dá),并且小鼠全身脂肪PHD2選擇性敲除,通過激活HIF信號(hào)通路激活了小鼠的褐色脂肪并增加能量消耗[54]。不同的是,在本實(shí)驗(yàn)室的研究中,在活體小鼠褐色脂肪上特異性敲除PHD2,顯著抑制了褐色脂肪的產(chǎn)熱過程,發(fā)現(xiàn)PHD2可以直接與線粒體產(chǎn)熱蛋白UCP1結(jié)合,通過促進(jìn)UCP1蛋白的羥基化修飾,增加UCP1蛋白穩(wěn)定性和表達(dá),并協(xié)同AMPK信號(hào)通路促進(jìn)褐色脂肪產(chǎn)熱,以減少脂肪沉積[55]。然而,PHD對(duì)脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣,更多的調(diào)控路徑仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,抑制PHD可減少動(dòng)物體脂肪沉積、脂肪酸攝取及脂肪變性等,PHD還可以參與褐色脂肪組織的產(chǎn)熱,這為PHD作為營養(yǎng)調(diào)控靶點(diǎn)改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。

4 小 結(jié)

本文在介紹PHD生理功能的基礎(chǔ)上,闡述了其在骨骼肌發(fā)育及脂肪沉積方面的調(diào)控作用及可能機(jī)制,為生產(chǎn)上提高畜禽產(chǎn)品的產(chǎn)量以及品質(zhì)提供了新的靶點(diǎn)。此外,PHD抑制劑也有望在畜禽生產(chǎn)中起到作用。目前的PHD抑制劑大多是廣泛的抑制,但PHD家族各個(gè)成員的作用都有不同,其具體機(jī)制并不十分明確,有待進(jìn)一步研究。因此,尋找PHD亞型特異性的抑制劑,或能為將來應(yīng)用于生產(chǎn)開辟新的道路。