枯草芽孢桿菌和酵母培養物聯合添加在斷奶仔兔上的應用效果研究

■ 刁 慧 湯文杰 張 晶 嚴鴻林 晏家友 周夢佳 黃崇波 李書偉

（1.四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066；2.四川省畜科集團有限公司，畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川 成都 610066；3.重慶市畜牧技術推廣總站，重慶 401121；4.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

隨著肉兔產業不斷發展，肉兔腸炎、腹瀉等腸道疾病和鼻炎、肺炎等呼吸道病給肉兔產業造成巨大經濟損失[1]。為了追求肉兔的生長速度和生產成績，高劑量無機微量元素和抗生素被長期添加到肉兔飼料中，但抗生素由于其耐藥性也給人們帶來了沉重的后果和嚴峻的考驗[2]。我國農業農村部發布的194 號公告規定退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑，這勢必會導致養殖業生產水平下降。酵母培養物是由酵母菌在特配的液體培養液和谷物培養基上經過深度發酵而成，終端產品包括變性的培養基、酵母細胞本身和細胞外代謝物等200 多種代謝產物，在機體腸道健康和免疫功能的改善上具有重要的作用[3]。枯草芽孢桿菌能破壞植物細胞的細胞壁，自身能產生維生素、氨基酸、促生長因子等多種容易被利用的物質，通過自身分泌的枯草菌素及產生的孢子來頡頏、競爭性排斥有害病原菌，維持腸道健康[4]。然而，酵母培養物和枯草芽孢桿菌在肉兔上的聯合使用未見報道。因此，研究以斷奶伊拉肉兔為試驗動物，探討益生菌和酵母培養物對肉兔生長性能、養分消化率、血清免疫、抗氧化和抗應激功能的影響，旨在揭示益生菌和酵母培養物在斷奶仔兔上的應用效果，為其在生產上的合理應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

選用396 只35 日齡、體重為（0.979±0.037） kg 斷奶的肉兔，隨機分為4 個處理（每個處理11 個重復，每個重復9 只兔），分別為基礎飼糧（對照組）、添加1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌、添加3 000 mg/kg 酵母培養物、添加1 000 mg/kg枯草芽孢桿菌+3 000 mg/kg酵母培養物（聯合添加組）。試驗兔在同一棟封閉式兔舍不銹鋼籠子（60 cm×60 cm×45 cm）里飼養，每個籠子3 只兔。預試期7 d，正試期30 d。每天08:00 和17: 00投喂2次飼料。試驗期間自由飲水。每日清掃兔舍1次，每隔4 d對兔舍進行噴霧消毒1次。仔兔免疫程序及其他飼養管理按兔場常規進行。

1.2 試驗飼糧

試驗飼糧參照De Blas 等[5]《兔的營養需要》進行配制，飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）

1.3 樣品采集

1.3.1 飼料樣

飼料樣品通過四分法進行采集，每個處理取200 g左右，放入-20 ℃冰箱保存待測養分的含量。

1.3.2 糞樣

于試驗第27～30 天，采用內源指示劑收糞法，進行消化試驗。消化試驗共4 d，進行直腸糞樣收集。混勻后加入10%硫酸和幾滴甲苯固氮防腐，65 ℃烘至恒重，粉碎過40目篩。

1.3.3 血樣

試驗結束時，每個重復選1 只接近平均體重的肉兔進行耳緣靜脈采血3 mL，4 ℃冰箱中靜置12 h，4 000 r/min離心10 min，分離出血清，-20 ℃保存待用。

1.4 測定指標

1.4.1 生長性能

試驗第0 天、第15 天和第30 天末，分別對每只兔進行空腹稱重。試驗期內，以重復為單位，記錄總投料量和總剩料量。根據ADG和投料量計算F/G。

1.4.2 養分表觀消化率

參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[6]測定CP、干物質（DM）、粗脂肪（EE）和CF，采用內源指示劑法（AIA 法）計算肉兔飼糧養分表觀消化率。內源指示劑鹽酸不溶灰分的測定方法參見GB/T 23742—2009《飼料中鹽酸不溶灰分的測定》。

1.4.3 血清抗氧化指標

用南京建成生物工程研究所有限公司生產的試劑盒，結合紫外光分光光度計（UV-1100，上海美普達）測定血清中抗氧化相關指標，包括丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。

1.4.4 血清免疫指標

用南京建成生物工程研究所有限公司生產的試劑盒，結合紫外光分光光度計測定血清中K、Na 和溶菌酶含量。血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、干擾素γ（IFN-γ）和白細胞介素-10（IL-10）含量采用ELISA 試劑盒測定，測定試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司，操作均按說明書進行。

1.4.5 血清抗應激指標

血清醛固酮、皮質醇和熱休克蛋白70（Hsp70）含量采用ELISA 試劑盒測定，測定試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司，操作均按說明書進行。

1.5 統計分析

所有數據均用Excel 2010 進行初步整理，采用SAS 8.0中的one-way ANOVA檢驗對數據進行統計分析，以P＜0.05作為差異顯著，0.05≤P＜0.10視為有趨勢。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對肉兔生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養物顯著提高斷奶仔兔1～15 d ADG，降低F/G，提高飼料轉化率（P＜0.05）。聯合添加組斷奶仔兔16～30 d ADG 顯著高于對照組，F/G 顯著低于對照組（P＜0.05）。從全期來看，枯草芽孢桿菌和酵母培養物聯合添加有提高斷奶仔兔ADG、降低F/G 的趨勢（P＜0.10）。

表2 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對斷奶肉兔生長性能的影響

2.2 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對肉兔養分表觀消化率的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養物或與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯用，顯著提高斷奶仔兔DM 和EE的表觀消化率（P＜0.05）；聯合添加組斷奶仔兔CF 的表觀消化率顯著提高（P＜0.05）；各處理組均可提高斷奶仔兔CP 的表觀消化率（P＜0.05）。

表3 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對斷奶肉兔養分消化率的影響(%)

2.3 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對肉兔免疫指標的影響

由表4 可知，與對照組相比，3 個處理組均可提高斷奶仔兔血清IgA 和IgG 的含量（P＜0.05）；飼糧添加3 000 mg/kg 酵母培養物或與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯用，顯著提高斷奶仔兔血清IgM 和IFN-γ的含量（P＜0.05）。聯合添加組斷奶仔兔血清IgA和IgM的含量顯著高于1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌組和3 000 mg/kg酵母培養物組（P＜0.05）。聯合添加組斷奶仔兔血清IFN-γ的含量顯著高于1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌組（P＜0.05）。與其他幾組相比，聯合添加組斷奶仔兔血清溶菌酶含量顯著提高（P＜0.05）。

表4 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對斷奶肉兔血清免疫指標的影響

2.4 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對肉兔抗氧化能力的影響

由表5 可知，與對照組相比，3 個處理組均可降低斷奶仔兔血清MDA 的含量（P＜0.05）；飼糧添加3 000 mg/kg 酵母培養物或與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯用均可提高斷奶仔兔血清T-AOC（P＜0.05）；聯合添加組斷奶仔兔血清SOD 活性顯著提高（P＜0.05）。

2.5 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對肉兔抗應激能力的影響

由表6 可知，與對照組相比，3 個處理組均可提高斷奶仔兔血清Hsp70 的含量（P＜0.05）；飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養物或與1 000 mg/kg枯草芽孢桿菌聯用，均可降低斷奶仔兔血清醛固酮和皮質醇的含量以及K/Na 比值（P＜0.05）。與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌組相比，聯合添加組斷奶仔兔血清醛固酮水平顯著降低（P＜0.05）。

表6 枯草芽孢桿菌和酵母培養物對斷奶肉兔抗應激能力的影響

3 討論

研究證實，幼齡動物消化系統在斷奶時發育并不完善，腸道微生物群落發育也不成熟，在斷奶后7～10 d 才會逐步建立適應固體飼料消化的正常微生物菌落[7]。因此，肉兔斷奶后添加酵母培養物和枯草芽孢桿菌可以幫助機體快速形成平衡的微生物菌落，改善營養物質消化，促進生長。已有大量試驗表明，酵母培養物對提高豬、雞、鵝、牛、羊的生產性能具有良好的效果，但在肉兔上的研究非常有限。酵母培養物富含酶、氨基酸、有機酸、活性小肽、甘露寡糖、未知生長因子等，進入胃腸道后促進肉兔腸道發育，減少斷奶對肉兔帶來的應激，從而提高生長性能。唐麗等[8]研究發現，日糧中添加0.1%、0.2%和0.3%的酵母培養物可顯著降低肉兔腹瀉率，添加0.2%和0.3%酵母培養物組擁有更高濃度的血清葡萄糖，有利于保證機體能量供給，維持正常生理功能，提高生長性能。Celaire 等[9]研究發現，飼糧中添加產植酸酶活性酵母培養物提高肉兔ADG，改善生長性能，提示酵母培養物是一種高效的兔用飼料添加劑。作為飼料中常用的益生菌種之一，枯草芽孢桿菌對改善畜禽生長性能具有正向效果。Guo等[10]比較不同水平枯草芽孢桿菌（105、106CFU/g 和107CFU/g）對肉兔生長性能的影響，結果發現，斷奶仔兔飼糧中添加106CFU/g 枯草芽孢桿菌組具有最佳的ADG。張燦[11]在獺兔上的研究得到了類似的結果。此外，枯草芽孢桿菌和其他的益生菌（乳酸桿菌、兔源脆弱擬桿菌）[4,12]或功能性添加劑（果寡糖、酸化劑、酶制劑等）[13]聯用進一步提高肉兔ADG，改善飼料轉化率。本試驗研究發現，飼糧單獨添加3 000 mg/kg 酵母培養物顯著提高斷奶仔兔1～15 d ADG、降低F/G；與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯用顯著提高斷奶仔兔16～30 d ADG、降低F/G。關于酵母培養物和枯草芽孢桿菌提高生長性能的原因，有研究者認為與其增加腸道微生物多樣性、改善腸道屏障功能和提高養分消化率有關[4,14]。

肉兔在斷奶時極易造成腸道功能紊亂，導致養分消化率降低，產生腹瀉。在本試驗中，飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養物或與1 000 mg/kg枯草芽孢桿菌聯用，顯著提高斷奶仔兔CP、DM 和EE 的表觀消化率，這與前人在酵母培養物或枯草芽孢桿菌上的研究結果一致。飼糧添加2%酵母培養物顯著提高獺兔CF、CP 和DM 的表觀消化率，飼糧添加3%酵母培養物顯著提高獺兔鈣的表觀消化率[15]。肉兔盲腸發達，微生物豐富，酵母培養物豐富的營養物質為盲腸中的微生物提供營養，從而提高飼料的消化率。飼糧添加100、200 mg/kg 或300 mg/kg 枯草芽孢桿菌均顯著提高獺兔總鈣和酸性洗滌纖維的表觀消化率，飼糧添加200 mg/kg 枯草芽孢桿菌顯著提高獺兔中性洗滌纖維的表觀消化率[11]。0.5×106CFU/g枯草芽孢桿菌和0.5×107CFU/g乳酸桿菌聯用提高斷奶仔兔DM、CP、中性洗滌纖維、有機質和總能的表觀消化率[4]。消化酶活性的高低和腸道形態結構的完整性是反映機體消化能力強弱的重要標志。枯草芽孢桿菌的添加或灌服顯著提高肉兔空腸淀粉酶和蛋白酶活性[16]，促進小腸黏膜細胞的增殖，提高十二指腸絨毛高度和隱窩深度比值，增大小腸吸收面積，可維持小腸上皮的正常結構，因而增強了機體對營養物質的吸收功能[12]。因此，酵母培養物和枯草芽孢桿菌可通過提高肉兔腸道消化酶活性，改善腸道形態結構，進而提高養分消化率。

氧化應激是指活性氧的產生與機體抗氧化防御能力之間的不平衡。對于幼齡動物來說，斷奶和感染可導致氧化應激，給細胞抗氧化防御系統帶來巨大的損害[17]。酵母培養物，由釀酒酵母經過深度發酵而成，終端產品包括200 多種代謝產物，具有抗氧化的功能[3]。本研究中發現，飼糧添加3 000 mg/kg酵母培養物和/或1 000 mg/kg枯草芽孢桿菌顯著降低血清MDA的含量，說明酵母培養物和枯草芽孢桿菌均具有降低脂質過氧化程度、降低細胞損傷的功能。機體清除自由基的能力與酶促和非酶抗氧化防御系統有關，SOD、CAT 和GSH-Px是體內具有代表性的酶性抗氧化物質，通過減少H2O2的積累對有毒化合物和氧自由基作出反應，TAOC 參與非酶抗氧化防御系統[18]。本研究中發現，飼糧單獨添加3 000 mg/kg酵母培養物，可提高斷奶仔兔血清T-AOC的含量，枯草芽孢桿菌和酵母培養物同時添加顯著提高斷奶仔兔血清SOD活性。本研究結果與謝開春[19]在肉兔上的研究結果一致，飼料中添加0.3%或0.6%枯草芽孢桿菌能顯著增加血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC，降低MDA 含量。由此說明，枯草芽孢桿菌和酵母培養物可以保護斷奶仔兔免受氧化應激的影響，具有維持抗氧化防御系統的功能。

斷奶應激除了引起機體產生氧化應激外，也會引起以促炎因子炎癥含量提高為標志的免疫反應[20]。體液免疫是動物機體特異性免疫的重要組成部分，抗體對毒素的中和作用和免疫調理吞噬作用都與免疫球蛋白的水平有關，淋巴細胞產生的免疫球蛋白在血清中的含量可以直接反映機體體液免疫狀態[21]。本研究中發現，枯草芽孢桿菌和酵母培養物單獨或聯合使用均可提高斷奶仔兔血清IgA、IgG 和溶菌酶的含量，酵母培養物單獨添加或與枯草芽孢桿菌聯用顯著提高斷奶仔兔血清IgM 和IFN-γ的含量，這與前人在獺兔或肉兔上單獨添加酵母培養物或枯草芽孢桿菌的研究結果一致。飼糧添加2%酵母培養物顯著提高獺兔血清IgA 與IgM 的含量，飼糧添加3.0%酵母培養物可以顯著提高血清中IgA 與IgG 的含量[15]。酵母培養物中含有豐富的作為抗原活性物質的細胞壁免疫多糖，通過與病原菌的代謝產物作用競爭性抑制其在腸道內活動，降低病原性微生物在腸黏膜的附著能力，同時活化多種免疫細胞，提高抗體含量，發揮免疫調節作用[22]。研究發現，腸道微生物對宿主的體液免疫和細胞免疫均有一定的調節作用，如誘導CD4+細胞的增殖，調節樹突狀細胞，影響腸黏膜Th 細胞因子的分泌，激活自然殺傷細胞[23-24]。新西蘭大白兔飼喂106CFU/g 枯草芽孢桿菌顯著提高血清中免疫球蛋白IgG 和IgA 的含量，增加胸腺和脾臟相對重量，提高盲腸菌群的物種多樣性，上調脾臟和空腸模式識別受體核苷酸結合寡聚化結構域蛋白1（NOD1）、NOD 樣受體家族 CARD 結構域 3（NLRC3）、富含亮氨酸重復序列的家族蛋白X1（NLRX1）表達量和下游的白介素1β（IL-1β）、白介素8（IL-8）和IFN-γ以及β防御素表達量，說明枯草芽孢桿菌可以通過激活NOD1誘導下游β防御素的表達從而提高機體抗病力[25]。飼糧添加300、400 mg/kg復合芽孢桿菌制劑，均能提高肉兔腸黏膜分泌型IgA含量、血清IgM、補體3、補體4的含量，降低肉兔盲腸大腸桿菌和總好氧菌數量，顯著增加乳酸桿菌、雙歧桿菌和總厭氧菌數量[26]。因此，從前面提到的所有證據來看，酵母培養物和枯草芽孢桿菌可通過調節細胞因子和抗體的產生誘導仔兔免疫應答。

皮質醇是一種糖皮質激素，能夠抑制機體生長和免疫功能，參與機體糖代謝和熱調節，其水平是衡量動物應激程度和生理機能變化的重要指標之一[27]。應激會激活下丘腦垂體腎上腺皮質軸，引起體內皮質醇水平升高，是抑制免疫細胞、導致動物機體免疫功能下降的主要因素[28]。醛固酮是一種鹽皮質激素，具有調節體內Na/K 平衡的功能，在維持機體內環境穩定中起著重要作用[29]。腦脊液和血漿中血管緊張素Ⅱ的含量在機體處于應激狀態下增高，促使醛固酮分泌增加，引起血管收縮，水鈉潴留，Na/K 上升，進一步加重血液動力的障礙[30]。肉雞上的研究發現，熱應激添加益生菌制劑顯著降低血清中皮質醇的含量，改善生長性能[31]。豬上的研究發現，在高溫高濕的狀態下，添加酵母培養物在一定程度上降低血清中的皮質醇濃度，改善長期熱應激導致的機體免疫功能下降[32]。奶牛上的研究發現，飼喂產甘油酵母培養物使血清皮質醇含量降低15.71%。本研究發現，飼糧添加酵母培養物或與枯草芽孢桿菌聯用顯著降低斷奶仔兔血清中醛固酮和皮質醇的含量以及K/Na 比值，這說明補充酵母培養物和枯草芽孢桿菌后改善了仔兔受應激的狀態。Hsp70 的表達與機體遭受熱應激刺激密切相關，能夠提高機體的抗應激能力[33]。研究發現，夏季動物血液淋巴細胞Hsp70 表達量顯著高于其他季節[34]。湯志宏等[35]研究發現，飼糧添加酵母培養物或復合益生菌顯著提高了熱應激奶牛42 d 血清中三碘甲腺原氨酸濃度，42 d 血清Hsp70 的含量分別提高了19.20%和23.46%，說明酵母培養物和益生菌可以通過提高血清Hsp70 濃度來增強奶牛抗應激能力。本試驗是在夏季7 月高溫進行，酵母培養物或枯草芽孢桿菌的添加顯著提高仔兔血清中Hsp70 濃度，提示補充酵母培養物或枯草芽孢桿菌可緩解仔兔遭受高溫應激帶來的負面影響。

4 結論

綜上，飼糧添加3 000 mg/kg 酵母培養物或與1 000 mg/kg 枯草芽孢桿菌聯用，可提高斷奶仔兔DM、CP 和EE 的表觀消化率；降低血清MDA 的含量，增加血清T-AOC，提高斷奶仔兔抗氧化能力；增加血清中IgA、IgG、IgM 和IFN-γ的含量，改善斷奶仔兔免疫力；降低血清醛固酮、皮質醇的含量，增加血清Hsp70 的含量，提高斷奶仔兔抗應激能力，最終改善生長性能。