西瓜遺傳轉化體系的優化

李鵬飛　陳子豪　張敏娟　豆峻嶺　楊森　劉東明　牛歡歡　楊路明

摘 要：以8種基因型西瓜為試驗材料，通過統計不同基因型材料的發芽率、不定芽誘導率，篩選出再生能力較強的基因型，并以其為材料對種子播種后培養時間、外植體造傷方式、菌液濃度、共培養時間及侵染方式等進行優化篩選，旨在建立高效的西瓜遺傳轉化體系。結果表明，在播種2 d時，YL、CYY298、CYY171及CYY137之間的種子發芽率差異不顯著且均顯著高于其他材料，但在不同濃度GA3誘導下，YL外植體的不定芽誘導率均最高；以YL材料為基礎進行體系優化，發現播種2 d后的種子狀態最適于侵染；刀片劃傷后的外植體熒光亮度最強，熒光率最高達74.9%；菌液濃度OD600=0.8，共培養時間為3 d時，外植體分化狀態最佳且熒光率最高為70.3%；真空負壓方式可以顯著提高侵染效率，外植體熒光率可達71.8%，愈傷組織誘導率高達60.2%；分化培養基中添加0.5 mg·L-1的GA3后不定芽的誘導率最高為74%；生根培養基中添加0.5 mg·L-1的IBA時生根率最高，平均生根數最多。

關鍵詞：西瓜；遺傳轉化；轉化效率；體系優化

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）03-09-11

Optimization of the genetic transformation system in watermelon

LI Pengfei，CHEN Zihao，ZHANG Minjuan，DOU Junling， YANG Sen， LIU Dongming， NIU Huanhuan，YANG Luming

（Horticulture College of Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046， Henan， China）

Abstract： In this study， eight watermelon genotypes were used as experimental materials， the germination rates and adventitious buds induction rates of different genotypes were counted and analyzed to screen out the optimal genotype with strong regeneration ability. The efficient watermelon genetic transformation system was optimized and screened through different sowing times， explant injury methods， bacterial liquid concentration， co-culture time， infection methods and other factors. The results showed that the seed germination rates of YL， CYY298， CYY171 and CYY137 had no difference and were significantly higher than that of other materials at 2 days of seeding， but the germination induction rate of YL was the highest at different concentrations of GA3. The system was optimized based on YL material， and it was found that the seed germination state was the best and most suitable for infection after 2 days of sowing. The fluorescence brightness of the explants after scratching the blade was the strongest， and the fluorescence rate was up to 74.9%. When the concentration of bacterial solution was OD600=0.8 and the co-culture time was 3 days， the explants were in the best differentiation state and the fluorescence rate was the highest at 70.3%. The infection efficiency can be significantly improved by negative pressure infection， and the fluorescence rate of explants can reach 71.8%， and the callus induction rate can reach 60.2%. The induction of adventitious shoots was up to 74% after the addition of 0.5 mg·L-1 GA3 to the differentiation medium.The highest rooting rate and the highest average number of roots were observed when 0.5 mg·L-1 of IBA was added to the rooting medium.

Key words： Watermelon; Genetic transformation; Transformation efficiency; System optimization

西瓜（Citrullus lanatus）是最受歡迎的園藝作物之一，因果肉多汁和口感甜美而備受消費者青睞。西瓜栽培歷史悠久，地域廣泛，近年來隨著種植面積和產量的增加，個性化育種需求也在不斷增加。高效穩定的遺傳轉化技術對于改良西瓜品種具有巨大潛力[1]。大量研究表明，西瓜是一種較難進行遺傳轉化的作物，轉化效率低仍是目前阻礙西瓜轉基因的主要難題[2]。傳統育種方法在西瓜優良性狀改良中存在育種周期長、難度大和遺傳性狀不穩定等問題，因此，利用轉基因技術改良西瓜性狀尤為重要。盡管轉基因技術在許多作物上已取得突破，但在西瓜中的應用進展緩慢且大部分研究仍集中在如何提高轉化效率方面。因此，通過優化影響西瓜遺傳轉化效率的因素，建立高效穩定的西瓜遺傳轉化體系對創制優良西瓜種質具有重要意義[3]。

植物遺傳轉化是一種通過將外源基因或DNA片段有目的地插入到受體植物基因組中，通過再生體系誘導獲得新植株的技術[4-5]。目前，遺傳轉化主要使用基因槍法[6-7]、花粉管通道法[8]、DNA浸胚法[9-10]和農桿菌介導法[11-15]等技術手段將外源基因導入植物基因組，以農桿菌介導法最為常用，具有操作簡單、轉化效率高和遺傳穩定性強等特點[16]。農桿菌能夠將攜帶外源基因的Ti質粒上的一段DNA轉移到植物細胞中，并整合到植物基因組中以實現表達[17-18]。通過農桿菌侵染，實現了外源基因向植物細胞的轉移和整合，進一步利用植物細胞的全能性，通過細胞或組織培養，最終由一個轉化細胞再生成完整的轉基因植株。通過植物遺傳轉化技術，可以向西瓜中導入具有抗病性[19]、耐逆性[20]、提高產量和品質[21]等優良性狀的外源基因，從而改良或增加西瓜的優異性狀。然而，目前西瓜的遺傳轉化研究仍處于起步階段，急需進一步優化。

西瓜離體再生能力和轉化效率受多種因素的影響，包括種子貯存時間[22]、基因型[23]、苗齡[24]、外植體類型[25-26]和子葉部位[27]等內部因素，以及培養基中激素種類如6-卞基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和濃度[24，28]、預培養時間[28]、共培養條件[29-30]等外部因素。筆者以8個基因型西瓜為試驗材料，通過統計不同基因型種子的發芽率、不定芽誘導率，最終篩選出YL為最優受體材料。以YL材料為基礎，通過對培養基中激素濃度、侵染方式、外植體造傷方式、菌液濃度、共培養時間等條件進行優化，篩選出高效且穩定的西瓜遺傳轉化體系，以期為西瓜基因功能研究及優良種質創制提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料及地點

供試西瓜材料共8種，分別為YL、M08、CYY171、CYY298、CYY137、WT2、WT4和WT8。其中YL、M08由西北農林科技大學李征教授實驗室饋贈；WT2、WT4、WT8是由河南農業大學瓜類作物基因組與分子育種實驗室從商品種中經多代自交分離純化的自交系，CYY171、CYY298、CYY137是由河南豫藝種業科技發展有限公司譚慧明老師提供的育種材料。

試驗于2021年9月至2022年4月在河南農業大學園藝學院瓜類作物基因組與分子育種實驗室進行。

1.2 培養基配方及方法

1.2.1? ? 培養基配方? ? 播種培養基：6.7 g 瓊脂粉溶解于1 L超純水。侵染液：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超純水，加入6-BA（終質量濃度1.5 mg·L-1），調pH至5.8～6.0。共培養培養基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超純水，加入6-BA（終質量濃度1.5 mg·L-1），調pH至5.8～6.0。分化培養基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超純水，加入6-BA（終質量濃度1.5 mg·L-1），調pH至5.8～6.0，加入特美汀（終質量濃度200 mg·L-1）。芽伸長培養基：4.43 g MS 524，30 g蔗糖，1 g肌醇，500 μL SH有機溶劑（0.5 g煙酸、0.5 g維生素B1、0.05 g維生素B6溶解于500 mL無菌水），溶解于1 L超純水，分別加入6-BA（終質量濃度0.1 mg·L-1）、NAA（終質量濃度0.1 mg·L-1），調pH至5.8～6.0，加入特美汀（終質量濃度200 mg·L-1）。生根培養基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超純水，調pH至5.8～6.0，加入特美汀（終質量濃度200 mg·L-1）。除播種培養基及侵染液外，其余培養基均需調pH后加入7 g·L-1的瓊脂粉以使培養基凝固；所有培養基均須在121 ℃下滅菌20 min。

1.2.2? ? 種子處理及發芽率統計? ? 挑選飽滿健康的西瓜種子，用適量55 ℃的無菌水浸種30 min后剝去外種皮，置于無菌三角瓶后移至超凈工作臺，先用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次；再用5%次氯酸鈉浸泡10 min（期間不斷搖晃），無菌水清洗4～5次，置于播種培養基上，放于28 ℃恒溫培養箱進行暗培養。每個西瓜材料設置3個重復，每個重復40粒種子，播種2 d后觀察每個基因型材料的發芽狀態，并分別統計發芽率，待種子下胚軸伸長至1～2 cm并有根毛長出時，獲得外植體并進行不定芽誘導。

發芽率/%=發芽種子數/種子總數×100。 （1）

1.2.3? ? 不定芽的誘導培養? ? 將上述8種適于不定芽誘導的西瓜種子，用無菌刀片于超凈工作臺上將子葉遠胚軸端，胚軸及子葉近胚軸端的部分組織切去（圖1-Ⅰ），將剩余部位的上下兩片子葉均勻切成12個外植體（圖1-Ⅱ），將外植體接種至含有不同赤霉素（GA3）質量濃度梯度（0、0.5、1.0、1.5和2.0 mg·L-1）的分化培養基上，在正常光周期（28 ℃，光照16 h·d-1，黑暗8 h·d-1，光照度3000 lx）條件下進行不定芽的誘導。每個處理設置3個重復，每個重復接種100個外植體，每個培養皿接種10個外植體。14 d后繼代一次，28 d后觀察出芽情況并統計不定芽的誘導率，根據結果篩選出再生能力最佳的基因型和不定芽誘導率最高時的GA3濃度。

不定芽誘導率/%=產生不定芽的外植體個數/接種外植體個數×100。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（2）

1.2.4? ? 種子播種后培養時間的篩選? ? 以篩選出的最佳基因型材料為基礎，比較種子在不同播種時間后（第1、2 、3 、4天）的發芽狀態及外植體的不定芽誘導率。每個培養時間設置3個重復，每個重復接種100個外植體，外植體放置在分化培養基上進行培養，14 d后繼代一次，28 d后統計不定芽誘導率，根據結果篩選出最適宜的種子培養時間。

1.2.5? ? 不定根的誘導及生根率的統計? ? 不定芽誘導28 d后，在超凈工作臺上將生長狀態較好的不定芽轉移至芽伸長培養基中，待不定芽伸長至2～3 cm時，將其轉移至生根培養基中誘導生根。設置添加IBA質量濃度梯度為0、0.5、1.0、2.0 mg·L-1的處理，每個處理3次重復，每個重復10個不定芽，培養20 d后觀察生根情況并統計生根率。

生根率/%=生根的不定芽數/總不定芽數×100。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（3）

1.2.6? ? 菌液濃度及共培養時間篩選? ? 將用于侵染的菌株接種至含有相應抗性的YEB液體培養基中，于28 ℃、230 r·min-1的搖床中過夜培養，用紫外分光光度計檢測菌液濃度。設置菌液濃度OD600為0.5、0.8、1.0共3個濃度梯度，同時設置共培養2、3、4 d，3個共培養時間，將以上3個濃度梯度與3個共培養時間相互組合成9組處理（A-I），每個處理3個重復，每個重復120個外植體，置于分化培養基5 d后統計外植體熒光率，采用購自上海路陽儀器有限公司（型號：LUYOR-3415RG）的手持熒光儀進行外植體熒光的篩選，外植體有熒光的計入統計，通體無熒光的不計入統計。根據熒光率篩選最適的菌液濃度和共培養時間。

外植體熒光率/%=熒光外植體數/總外植體數×100。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（4）

1.2.7? ? 外植體造傷方式篩選? ? 以篩選出的最佳基因型材料、種子培養時間、菌液濃度和共培養時間為基礎，對獲得的外植體進行不同造傷處理，分別采用CK處理（不進行造傷）、刀片劃傷（用無菌刀片在外植體表面輕劃3刀）以及納米刷造傷（用納米刷在外植體表面刷3次）3種處理方式。每個處理3個重復，每個重復120個外植體，并在侵染后觀測外植體熒光率和分化狀態。熒光強度以“+”表示，“+”越多表示熒光越強。

1.2.8? ? 侵染方式的篩選? ? 進一步以篩選出的最佳基因型材料、種子培養時間、菌液濃度和共培養時間、外植體造傷方式為基礎，分別選擇浸泡侵染、真空負壓侵染和超聲波輔助侵染3種方式，每個處理3次重復，每個重復120個外植體，共培養后置于分化培養基5 d后統計外植體的熒光率及愈傷組織誘導率。

愈傷組織誘導率/%=產生愈傷組織的外植體數/總外植體數×100。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （5）

1.3 數據統計與分析

利用Excel 2019進行試驗數據統計與作圖，采用SPSS 26.0進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同基因型西瓜材料發芽率及發芽狀態對比

以8個基因型西瓜為研究對象，每個基因型3個重復，每個重復40粒西瓜種子，統計發芽率（圖2），并觀察播種培養2 d后的發芽狀態（表1）。結果表明，YL、CYY298、CYY171及CYY137基因型之間的發芽率差異不顯著，分別為90.1%、85.3%、79.7%和82.3%，但均顯著高于其他材料；WT8和M08的種子發芽率最低，僅為18.7%和24.7%，顯著低于其他材料；WT2和WT4居中，分別為39.0%和43.6%。發芽狀態的觀察結果表明，CYY298和YL均可發芽且均有根毛出現以及胚根的伸長；CYY171和CYY137的萌發狀態無差異，基本均可發芽且根毛出現并有部分胚根伸長；WT8、M08、WT2和WT4在第2天時的狀態整體較差，除M08有少部分根毛出現外，其余3種基因型均無根毛的出現以及胚根的伸長。由以上結果可知，YL和CYY298整體的發芽率及發芽狀態較好，適合選為再生材料。

2.2 不同GA3濃度對不同基因型西瓜不定芽誘導的影響

不同GA3濃度對8個不同基因型西瓜不定芽誘導的影響如圖3所示，在不同GA3濃度下YL的不定芽誘導率均遠高于其他基因型，CYY298次之；8個基因型西瓜在0.5 mg·L-1 的GA3濃度下不定芽誘導效果均最佳，YL的誘導率最高為74%，CYY298次之，但僅為45%。隨著GA3濃度的升高，8個基因型西瓜的不定芽誘導率均呈先上升后下降的變化趨勢。由此可知，添加一定濃度的GA3可以促進不定芽的誘導，而YL的不定芽誘導率遠高于其他基因型材料，因此更適合作為再生材料。

2.3 不同基因型對不定芽誘導的影響

筆者進一步通過在分化培養基中添加0.5 mg·L-1的GA3，觀察外植體在分化培養1周后的狀態（圖4-Ⅰ），并統計外植體誘導28 d后的不定芽誘導率（圖4-Ⅱ），探究相同GA3濃度下不同基因型的不定芽誘導能力。結果表明，在分化培養1周后，不同基因型外植體的分化狀態不同，YL在分化1周后誘導出淺綠色愈傷組織，且形態致密緊湊，分化狀態最佳；CYY298、CYY171及CYY137次之，WT8、WT2及WT4的外植體雖然有膨大但效果不及CYY298、CYY171和CYY137；M08的外植體分化效果最差，整體呈現淡黃色，邊緣愈傷組織分化也不明顯。不定芽誘導率的結果表明，YL早期的外植體分化狀態最佳，后續的不定芽誘導率也最高，達75.0%，顯著高于其他基因型材料；CYY298和CYY171的誘導率次之，分別為41.7%和43.0%，兩者的差異不顯著；M08早期外植體的分化效果雖然最差，但后續的不定芽誘導率與CYY137之間無差異，且均顯著高于WT8、WT2；8種基因型中WT8和WT2的不定芽誘導率最低，僅為17.0%和21.0%。

由以上結果可知，不同基因型材料的再生能力存在差異，播種2 d后種子的發芽率、不同GA3濃度對不定芽誘導率，以及不同基因型之間不定芽誘導率的統計結果綜合分析，發現8種基因型材料中YL是最適合的再生材料，可作為遺傳轉化體系優化的受體材料。

2.4 種子播種后培養時間對不定芽誘導的影響

以YL為研究對象，設置4個種子播種后培養時間（第1、2、3、4天），觀察種子萌發狀態（圖5-Ⅰ）并獲取外植體后，分別接種至分化培養基，培養28 d后統計不定芽誘導率（圖5-Ⅱ）。結果表明，播種培養1 d后，僅有少數種子的下胚軸開始伸長，并且不定芽誘導率也較低，為36.7%；播種培養2 d后，除極個別種子外，下胚軸均伸長至1～2 cm，此狀態下的外植體不定芽誘導率最高，可達74.6%；播種3 d后，少數種子的兩片子葉展開，下胚軸已伸長至3 cm左右，不定芽的誘導率下降至46.9%；播種4 d后，種子的胚根已伸長超過6 cm，根毛大量分化，2片子葉呈現嫩黃、展開的狀態，不定芽的誘導率最低，僅為27.5%。由此可知，播種2 d后的種子最適宜于后續不定芽的誘導。

2.5 不同IBA濃度對生根效果的影響

以播種2 d后的YL為研究對象，通過觀察生根狀態（圖6-I）、統計每個不定芽的平均生根數量（表2）以及統計生根率（圖6-II），探究不同IBA濃度對生根效果的影響。結果表明，IBA質量濃度為0.5 mg·L-1時，生根率最高為72.4%，平均生根數量最多，為6.3個，且根系健壯并有須根產生；隨著IBA質量濃度增加，不定芽生根率降低，平均生根數量減少，IBA質量濃度為1.0 mg·L-1時，生根率為59.6%，平均生根數量4.3個；IBA質量濃度為2.0 mg·L-1時，其生根率僅為14.4%，平均生根數量為1.8個。綜上，較高質量濃度的IBA處理會抑制不定芽生根，IBA質量濃度為0.5 mg·L-1時生根效果最佳。

2.6 不同菌液濃度和共培養時間對轉化效率的影響

以YL為研究對象，將3個菌液濃度梯度（OD600為0.5、0.8、1.0）與3個共培養時間（2、3、4 d）共設置成9組處理（A～I），觀察5 d后外植體的生長狀態（表3）并統計熒光率（圖7），探究菌液濃度和共培養時間對轉化效率的影響并對其生長狀態進行觀察。

結果表明，當共培養時間為2 d時，OD600=0.8和1.0時的外植體生長狀態良好，且熒光率之間無顯著差異，分別為46.1%和44.6%，均顯著高于OD600=0.5的熒光率；共培養3 d，OD600=0.8時的外植體生長狀態及熒光率均最高，熒光率達70.3%，顯著高于OD600=0.5和1.0時的熒光率；共培養4 d時，OD600=0.5，0.8和1.0時的熒光率分別為47.4%，60.2%和21.4%，雖然OD600=0.8時的熒光率最高，但部分外植體邊緣已有菌液溢出；在9組處理中，共培養4 d，OD600=1.0時的熒光率最低，外植體分化狀態也最差。因此，最適合的菌液侵染濃度為OD600=0.8，最適宜的共培養時間為3 d，此時的外植體分化狀態較好且熒光率也最高。

2.7 不同造傷方式對轉化效率的影響

以YL為研究對象，在播種后培養2 d，菌液濃度OD600為0.8、共培養時間為3 d時，設置3種外植體造傷方式，通過觀察外植體分化狀態（表4）并統計熒光率（圖8），探究不同造傷方式對轉化效率的影響。

結果表明，在CK處理下，外植體正常膨大，但后續邊緣僅有部分區域誘導出芽，外植體熒光率為59.7%；納米刷造傷處理后，雖然造傷處的熒光信號加強，但外植體表面分化白色愈傷，后期不定芽分化緩慢，但熒光率達到65.2%，高于CK；刀片劃傷處理后，外植體在共培養階段膨大較好且邊緣呈現綠色的愈傷組織，外植體熒光率也最高，可達74.9%。綜上可知，采用刀片劃傷外植體的方式可以進一步提高轉化效率，且不會影響外植體再生狀態。

2.8 不同侵染方式對轉化效率的影響

以播種培養2 d后的YL為研究材料，在菌液濃度OD600=0.8、共培養時間為3 d的優化體系下，設置3種侵染方式，分別觀察外植體的分化狀態，統計熒光率和愈傷組織誘導率（表5），探究不同侵染方式對轉化效率的影響。結果表明，在浸泡侵染下，外植體在共培養后的熒光率最低，僅為30.6%；在負壓侵染處理下，外植體的熒光率和愈傷組織誘導率均最高，分別為71.8%和60.2%；超聲輔助侵染后外植體熒光率顯著高于浸泡侵染處理，但顯著低于負壓侵染，而愈傷誘導率最低，僅為33.6%。此外，在植物活體成像儀觀察下發現，負壓侵染處理后外植體膨大狀態及分化狀態均較好且熒光更亮（圖9）。綜上可知，負壓侵染為最佳侵染方式，可以有效提高轉化效率。

3 討論與結論

植物遺傳轉化是轉基因及以轉基因技術為基礎的基因組編輯、功能基因組研究以及分子設計育種的關鍵。相對于基因組學和基因編輯技術的迅速發展，轉基因技術中再生體系的優化和建立成為目前限制功能基因組學快速發展的瓶頸。影響植物離體器官再生的主要因素有基因型、外植體部位和植物生長調節劑等[31]。目前對西瓜遺傳轉化的研究雖然已有報道，但外植體再生效率低，以及遺傳轉化體系的不穩定仍是制約其在西瓜中高效利用的主要因素[32]。

基因型是目前制約西瓜高效遺傳轉化的關鍵因素之一，極大地影響著外植體的再生能力。筆者以8種不同西瓜基因型材料為基礎，通過對比8種材料在相同時間內種子的萌發速率，外植體產生不定芽的速率，發現不同基因型之間存在較大差異，但綜合對比發現，YL的表現最佳，最適宜于作為西瓜遺傳轉化的受體材料。試驗結果表明，YL種子在播種培養后的第2天即可達到適于后續不定芽再生的最佳狀態；在分化早期階段，外植體邊緣可形成淺綠色愈傷組織，并且該狀態的愈傷組織在后期也表現出最好的再生能力，而其余基因型材料在分化早期，邊緣形成愈傷組織的能力均弱于YL，這也可能是其后期不定芽誘導率顯著低于YL的原因。除了基因型的差異影響不定芽再生之外，目前也有研究表明，通過在轉化載體中添加不定芽再生促進基因，可以顯著提高轉化效率。Debernardi等[33]發現過表達小麥生長調節因子GRF4和GIF1組成的嵌合蛋白提高了小麥再生效率和再生速度，同時增加了可轉化小麥基因型的數量；潘文波等[34]發現在西瓜中共表達AtGRF5和AtGIF1可以顯著提高西瓜遺傳轉化效率；馮琴等[35]通過在轉化載體中過表達內源嵌合基因ClGRF4和ClGIF1，在西瓜中實現了高效的、不依賴基因型的遺傳轉化。因此，筆者所優化的遺傳轉化體系，可在后續的試驗中同時融合不定芽再生促進基因，以獲得更高的遺傳轉化效率。此外，在后續研究中還可以通過繼續探究不同生長調節因子對轉化效率的影響，以期獲得完全不依賴基因型的高效西瓜遺傳轉化體系。

除基因型的影響因素外，適宜的激素濃度也是提高不定芽誘導率的關鍵，與宋道軍等[36]在誘導不定芽階段使用的激素不同，筆者通過在分化培養基中添加適宜質量濃度的GA3，有效提高了外植體分化效率，并且還發現GA3誘導不定芽的再生存在劑量效應，0.5 mg·L-1時的誘導效果最佳，結果可為探究GA3對其他作物外植體不定芽誘導的影響提供參考。此外，研究還發現不同播種天數的西瓜種子，外植體不定芽誘導率之間差異顯著。筆者采用播種后2 d的西瓜YL材料，獲得了較高的不定芽誘導率，相較于趙彩萍等[37]認為苗齡4～5 d時子葉誘導率最高的結果縮短了1～2 d的播種時間。在誘導生根階段，筆者通過在生根培養基中添加0.5 mg·L-1的IBA有效提高了不定芽生根速率及生根數目，研究結果與劉靜等[38]使用0.4 mg·L-1的IBA誘導不定芽生根的結果略有差異，可能是由于所用西瓜基因型不同，但也由此表明適宜濃度的IBA才可更好地誘導西瓜不定芽生根。

農桿菌菌液濃度和共培養時間也是目前植物遺傳轉化體系優化中重點關注的因素，菌液濃度過低則影響外植體的侵染效率，而菌液濃度過高時外植體周圍極易出現溢菌現象。筆者研究認為，農桿菌菌液濃度為OD600=0.8且共培養時間為3 d時，熒光效率較高，與張志忠等[39]的研究結果一致。造傷處理外植體可以通過增加菌液附著在外植體上的概率，進而影響侵染效率。筆者在本研究中共采用了3種造傷方式處理外植體，發現刀劃造傷處理下的侵染效率最高。雖然已有研究表明，納米刷造傷處理外植體可以獲得較高的轉化效率，但在本研究中發現，經納米刷處理后的外植體雖然在短時間內具有較高的熒光率，但隨著培養時間的延長熒光亮度逐漸減弱，并且在分化后期邊緣易產生白色愈傷組織，極大地影響了后期不定芽的再生能力。不同侵染方式對西瓜轉化效率也有影響，相較于直接浸泡侵染和超聲輔助侵染，通過負壓侵染處理外植體，可以獲得較高的轉化效率，可能是由于真空負壓狀態下，外植體細胞壁更加松弛，進而提高了轉化效率。超聲輔助侵染后，外植體雖然有較高的熒光率，但愈傷組織誘導率下降，這可能與超聲處理后外植體在一定程度上受損有關，后續可進一步通過優化超聲波的強度和時間繼續探索其對轉化效率的影響。

綜合以上試驗結果，筆者發現選用YL作為受體材料，種子播種2 d后，外植體在添加0.5 mg·L-1GA3的培養基中不定芽的誘導率最高；YL誘導出的不定芽在IBA質量濃度為0.5 mg·L-1時生根效果最佳；采用負壓侵染與刀劃造傷外植體相結合的方式，菌液濃度OD600=0.8且共培養3 d時的外植體熒光率最高。

參考文獻

[1] 黃華寧，楊小振，馬建祥，等．中國西瓜遺傳育種研究進展[J]．北京農業，2014（12）：22-26.

[2] 趙小強，牛曉偉，范敏．農桿菌遺傳轉化西瓜的影響因素及應用研究進展[J]．浙江農業學報，2016，28（1）：171-178.

[3] 陳磊，龐曉虹，劉宏宇．西瓜組織培養及遺傳轉化的研究進展[J]．北方園藝，2009（2）：136-140.

[4] 周宇晴，任豆．再生體系及農桿菌介導的遺傳轉化體系的構建[D]．廣州：華南農業大學，2018.

[5] 李君，李巖，劉德虎．植物遺傳轉化的替代方法及研究進展[J]．生物技術通報，2011（7）：31-36.

[6] 任春梅，董延瑜，洪亞輝，等．基因槍介導的西瓜遺傳轉化研究[J]．湖南農業大學學報（自然科學版），2000，26（6）：432-435．

[7] SURATMAN F，HUYOP F，WAGIRAN A，et al．Biolistic transformation of Citrullus vulgaris Schrad （Watermelon）[J]．Biotechnology，2010，9（2）：119-130.

[8] CAO S，NIU J，CAO Q，et al．Transformation of the rolB gene via the pollen-tube pathway to obtain transgenic pomegranate plants[J]．Acta Horticulturae，2019，1245：19-26.

[9] 劉傳雪，潘國君，張淑華，等．應用浸胚法轉化寒地水稻的試驗研究[J]．北方水稻，2009，39（2）：8-11.

[10] 丁錦平．用浸胚法將大豆DNA導入番茄初步研究[J]．廣東農業科學，2013，40（21）：131-135.

[11] BATES R，CRAZE M，WALLINGTON E J．Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape （Brassica napus）[J]．Current Protocols in Plant Biology，2017，2（4）：287-298．

[12] TABEI Y，YAMANAKA H，KANNO T．Adventitious shoot induction and plant regeneration from cotyledons of mature seed in watermelon（Citrullus lanatus L.）[J]．Plant Tissue Culture Letters，1993，10（3）：235-241.

[13] WU H W，YU T A，RAJA J A，et al．Generation of transgenic oriental melon resistant to Zucchini yellow mosaic virus by an improved cotyledon-cutting method[J]．Plant Cell Reports，2009，28（7）：1053-1064.

[14] BEZIRGANOGLU I，HWANG S Y，SHAW J F，et al．Efficient production of transgenic melon via Agrobacterium-mediated transformation[J]．Genetics and Molecular Research，2014，13（2）：3218-3227．

[15] 王平勇，徐永陽，趙光偉，等．發根農桿菌介導西瓜轉基因過表達體系的建立[J]．果樹學報，2019，36（12）：1763-1770.

[16] 熊換英，鐘偉光，張壽文．農桿菌介導的植物遺傳轉化影響因素研究進展[J]．安徽農業科學，2012，40（17）：9214-9217.

[17] 李文硯，孔方南，盧艷春，等．農桿菌介導的草莓遺傳轉化研究進展[J]．黑龍江農業科學，2016（3）：143-146.

[18] 高佩，尹銳，林彥萍，等．農桿菌介導的番茄遺傳轉化研究進展[J]．北方園藝，2016（14）：192-197.

[19] PARK S M，LEE J S，JEGAL S，et al．Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV（Cucumber green mottle mosaic virus）infection [J]．Plant Cell Reports，2005，24（6）：350-356.

[20] 孫治圖．農桿菌介導的甜菜堿基因轉化西瓜的初步研究[D]．重慶：西南大學，2008.

[21] 常尚連．西瓜糖代謝及甜瓜酸性轉化酶反義基因的西瓜遺傳轉化[D]．山東泰安：山東農業大學，2006.

[22] 王果萍，劉劍華，高平平，等．貯存時間對西瓜種子活力的影響[J]．山西農業科學，1998（4）：56-59.

[23] 孫治圖，許勇，張海英，等．西瓜離體再生高效基因型材料的篩選[J]．中國瓜菜，2008（3）：5-9.

[24] YU T A，CHIANG C H，WU H W，et al．Generation of transgenic watermelon resistant to Zucchini yellow mosaic virus and Papaya ringspot virus type W[J]．Plant Cell Reports，2011，30（3）：359-371．

[25] 秦新民，張麗珍，李文蘭．西瓜高效再生系統的研究[J]．廣西師范大學學報（自然科學版），2003，21（2）：75-78.

[26] 董焱，張潔，張海英，等．西瓜未成熟胚高效再生體系的建立[J]．中國瓜菜，2014，27（3）：10-13.

[27] 萬勇，張錚，劉紅梅，等．西瓜組織培養快速繁殖的初步研究[J]．江西農業學報，2002，14（4）：47-50.

[28] CH M A，MOON C Y，LIU J R，et al．Agrobacterium-mediated transformation in Citrullus lanatus[J]．Biologia Plantarum，2008，52：365-369.

[29] 劉麗鋒．西甜瓜轉基因抗病毒研究[D]．武漢：華中農業大學，2015.

[30] SRIVASTAVA D，ANDRIANOV V，PIRUZIAN E．Tissue culture and plant regeneration of watermelon （Citrullus vulgaris Schrad. cv. Melitopolski）[J]．Plant Cell Reports，1989，8（5）：300-302.

[31] 王團團，緱晨星，夏磊，等．黃瓜10個基因型材料外植體內源激素水平及比例對其離體再生的影響[J]．園藝學報，2021，48（9）：1731-1742.

[32] 張曼，徐錦華，劉廣，等．西瓜‘SM1高效遺傳轉化體系的構建[J]．分子植物育種，2021，19（2）：498-503.

[33] DEBERNARDI J M，TRICOLI D M，ERCOLI M F，et al．A GRF-GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants[J]．Nature Biotechnology，2020，38（11）：1-6.

[34] PAN W，CHENG Z，HAN Z，et al．Efficient transformation and genome editing of watermelon assisted by genes that encode developmental regulators [J]．Cold Spring Harbor Laboratory，2022，23（4）：339-344.

[35] FENG Q，XIAO L，HE Y，et al．Highly efficient， genotype-independent transformation and gene editing in watermelon（Citrullus lanatus）using a chimeric ClGRF4-GIF1 gene [J]．Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（24）：2038-2042．

[36] 宋道軍，陳若雷，尹若春，等．西瓜高效組織培養再生體系的初步研究[J]．中國西瓜甜瓜，2000，13（4）：8-11.

[37] 趙彩萍，王榮華，張治平，等．西瓜植株再生優化體系的研究[J]．安徽農業大學學報，2009，36（2）：303-308.

[38] 劉靜，趙強，王旭英，等．西瓜高效離體培養再生植株的研究[J]．北方園藝，2012（4）：108-110.

[39] 張志忠，吳菁華，呂柳新．西瓜高頻再生系統的研究[J]．中國農學通報，2004，20（2）：151-153.

收稿日期：2023-10-10；修回日期：2024-01-04

基金項目：河南省科技研發計劃聯合基金（222103810009）；河南省重大科技專項（221100110400）；河南省農業良種聯合攻關項目（2022010503）

作者簡介：李鵬飛，男，在讀碩士研究生，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail：2275147174@qq.com

通信作者：牛歡歡，女，講師，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail：niuhh@henau.edu.cn

楊路明，男，教授，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail：lumingyang@henau.edu.cn