高效液相色譜法測定醬油中三氯蔗糖含量不確定度的評定

崔婷婷，祁 偉,*，何文江，張家琪，黃青春,*

（1.中國地質調查局呼和浩特自然資源綜合調查中心，內蒙古呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區特種設備檢驗研究院烏蘭察布分院，內蒙古烏蘭察布 012000）

醬油常用多種谷物經過發酵等多種工藝釀造而成，是生活中常用的調味品[1-2]。三氯蔗糖又稱蔗糖精，為蔗糖甜度的600 倍以上，是一種能量比較低、沒有營養的甜味劑，不能被人體吸收，可以有效預防肥胖和齲齒，無需胰島素代謝，適宜糖尿病人食用[3-6]。在生產過程中常常作為醬油的一種食品添加劑，可以改善口感，抑制咸味[7-10]。但是，三氯蔗糖屬于人工合成甜味劑，結構穩定，已經作為一種新型的持久污染物得到關注，需嚴格控制食品中添加的三氯蔗糖量[11]，根據文獻報道過量使用三氯蔗糖不僅會破壞環境甚至可能會對人體造成傷害[12-16]。GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[17]中明確規定，三氯蔗糖的使用限量值為0.25 g/kg。

目前三氯蔗糖含量的主要檢測方法有：液相色譜法[11,18]、氣相色譜法[19]、氣相色譜質譜法[1]、超高效液相色譜質譜法[20-21]。在實際檢測過程中，可能存在檢測結果與限量值接近，或剛超限量值，影響結果判斷，而測量不確定度是表征被測量數值的分散性，與測量結果具有重要聯系的參數，不確定度的分析與評定可直接體現檢測結果的準確性，能更加客觀、合理地評價檢測結果，是評價檢測結果的重要指標，直接影響檢測結果是否符合限量值要求[22-24]。因此，必須要對檢測結果進行不確定度評定，分析檢測各過程對不確定度的影響，從而保障檢測結果的準確性和可靠性。

先前有文獻報道關于利用高效液相色譜法評定醬腌菜[25]、保健品益生菌粉[11]、食用檳榔[26]、飲料[27]中三氯蔗糖的不確定度。目前報道的醬油中三氯蔗糖含量檢測的不確定度評定只有利用高效液相色譜-質譜聯用法[28]，而依據食品安全國家標準GB 22255-2014《食品安全標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》[29]利用高效液相色譜法檢測醬油中三氯蔗糖含量，對結果進行不確定度評定，目前國內外沒有研究報道。

因此，本文建立了高效液相色譜法測定醬油中三氯蔗糖的不確定度的評定方法，明確在醬油中三氯蔗糖含量檢測過程中帶來的各種不確定度評定的因素及占比，并且進行了分析，提出了改進方法，為檢測人員提供科學、合理的檢測數值，以期提高檢測結果的準確性，保證最終結果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬油樣品 隨機市購；三氯蔗糖標準品 純度99.7% ，壇墨質檢科技股份有限公司；甲醇、乙腈色譜級，國藥集團；稀釋三氯蔗糖標準品溶劑的水符合國家標準GB/T 6682-2008[30]用水要求。

UltiMate3000 高效液相色譜儀，配蒸發光散射檢測器 Thermo Fisher；BSA200S-WEI 電子天平賽多利斯；HZY-324/523 電子天平 福州志華科學儀器；XYG-90-H 超純水機 北京湘順源有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 稱取0.1 g（精確至0.001 g）三氯蔗糖標準品，定容于100 mL 容量瓶中，即得濃度為1 mg/mL 的三氯蔗糖標準儲備液，用移液管吸取三氯蔗糖標準儲備液1、2、5、10、20 mL 于50 mL容量瓶中，定容，即得濃度為0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 mg/mL 的三氯蔗糖標準使用液用于制備標準曲線。

1.2.2 樣品處理 實驗醬油樣品處理方法按照國家標準GB 22255-2014[29]方法要求進行。醬油樣品混勻后，稱取2 g 置于50 mL 離心管，加1.0 g 中性氧化鋁，加3 mL 水，渦旋混合器振蕩3 min 后加入15 mL 甲醇，繼續振蕩30 s，超聲波提取20 min，3000 r/min 離心10 min，將上清液移入50 mL 離心管中。沉淀物加入5.0 mL 甲醇水溶液（75+25），渦旋混合30 s，3000 r/min 離心10 min，重復2 次，將上清液合并于150 mL 分液漏斗中。在150 mL 分液漏斗中，加入30 mL 正己烷，震搖分層，下層水相移入蒸發皿，置水浴蒸干，用9 mL 水沖洗3 次后合并，超聲波提取5 min，3000 r/min 離心10 min。3 mL甲醇洗脫，蒸干洗脫液，用乙腈+水=11+89（V/V）溶解，0.45 μm 過濾，備用。

1.2.3 液相色譜條件 采用C18柱（粒徑5 μm，4.6 mm×150 mm）；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈+水（V/V），洗脫程序及比例見表1；流速：1.0 mL/min；進樣量20 μL；蒸發光檢測器：溫度70 ℃，氣體流速1.5 L/min。

表1 液相色譜洗脫程序Table 1 Liquid chromatography elution procedure

1.2.4 數學模型

式中：X—三氯蔗糖在醬油樣品中的含量（g/kg）；C—三氯蔗糖的濃度（由標準曲線知）（mg/mL）；V—醬油樣品定容體積（mL）；m—醬油樣品質量（g）；1000—換算系數[29]。

1.3 數據處理

利用UltiMate 3000 高效液相色譜儀數據采集工作站進行數據采集和處理，Microsoft Excel 2021、PowerPoint 2021 進行數據統計、繪制圖表。

2 結果與分析

根據1.2.4 數學模型、檢測過程分析，不確定度來源有：醬油樣品重復測定，三氯蔗糖標準品、醬油樣品稱量，三氯蔗糖標準品純度，三氯蔗糖標準品建立的標準曲線，三氯蔗糖標準品溶液配制過程中所使用的玻璃器具，加入標準溶液后的回收率，測量三氯蔗糖含量的液相色譜儀不確定因素。不確定度分量來源見圖1。

圖1 測量不確定度分量魚骨圖Fig.1 Measurement uncertainty component fishbone diagram

2.1 樣品重復測定的不確定度Urel1

醬油樣品進行6 次測試，結果為：0.0479、0.0480、0.0475、0.0481、0.0477、0.0476 g/kg，平均值為：=0.0478 g/kg，根據公式（2），醬油樣品重復測定引起的不確定度U（）。

2.2 稱量引入的不確定度Urel2

2.2.1 標準品稱量引入的不確定度U標（M1）用BSA200S-WEI 電子天平稱量三氯蔗糖標準品，根據檢定校準證書（證書編號：力學字第2022TP0034），最大允許誤差0.5 mg。標準不確定度：U標（m1）=（矩陣分布評定，），三氯蔗糖標準品稱量為101.2 mg，相對不確定度U標（M1）=0.288675/101.2=0.002852521。

2.3 三氯蔗糖標準品純度引入的不確定度Urel3

根據生產廠家附贈的標準品證書可知，三氯蔗糖標準品純度為99.7%，擴展不確定度0.5%。按照矩形分布評定其標準不確定度為0.002886751，相對不確定度為Urel3=0.002886751/0.997=0.002895438。

2.4 標準曲線擬合的不確定度Urel4

根據國家標準[29]，5 個不同濃度的三氯蔗糖含量點，數據見表2。

表2 標準曲線數據表Table 2 Standard curve data table

本實驗對醬油樣品檢測進行6 次重復，醬油樣品進樣液中三氯蔗糖峰面積對應的濃度結果分別為：0.0959、0.0977、0.0952、0.0964、0.0955、0.0953 mg/mL，平均質量濃度C 為0.0960 mg/mL，因此，由標準曲線擬合的不確定度按（3）計算：

將上述帶入公式（3）計算結果：標準曲線引入的標準不確定度U（c）=0.006524622，相對不確定度Urel4=U（c）/C=0.067964808。

2.5 配制過程所用玻璃器具校準的相對合成標準不確定度Urel5

實驗過程中玻璃器具的不確定度為：溫度（T）和容量允許誤差（δ）。實驗過程操作溫度25 ℃，而國家計量技術規程JJG 196-2006[31]要求為20 ℃，相差5 ℃，故而只需考慮稀釋三氯蔗糖標準品的溶劑（水）體積膨脹[32]。膨脹系數為0.00021 ℃-1，溫度（T）帶來的不確定度為（V 為玻璃器具規格，按矩形分布計算）；容量允許誤差（δ）帶來的不確定度為（按三角分布）。

按照上述方法，本實驗中使用5 次50 mL 容量瓶、1 次100 mL 容量瓶，1、2、5、10、20 mL 單標線移液管各1 次。配制過程的不確定度見表3。

表3 玻璃器具的使用引入的不確定度Table 3 Uncertainty introduced by the use of glassware

由表3 數據，配制過程的相對合成標準不確定度為：

Urel5= [(0.000730867)2× 5+(0.000730867)2+(0.00292133)2+ (0.002129358)2+ (0.001366565)2+(0.00101694)2+(0.000861684)2]1/2=0.004462903。

2.6 回收率引入的相對不確定度Urel6

稱取3 份無三氯蔗糖的醬油空白樣品，加入濃度為0.02、0.05、0.2 mg/mL 的標準溶液，測定實際濃度，計算回收率（表4）。

表4 回收率測定結果（n=3）Table 4 Determination results of recovery rate (n=3)

由表4 數據，測定3 次回收率，平均回收率為94.33%，標準偏差S 為4.75%，則回收率引入的標準不確定度u（rec）=S/=1.583333333%，相對不確定度Urel6=u（rec）/94.33%=0.016785045。

2.7 液相色譜儀引入的相對不確定度Urel7

依據UltiMate3000 液相色譜儀檢定證書（證書編號：化學字第2021YX0005）定量測量重復性為1.1%，按照均勻分布計算k=，則液相色譜儀的相對不確定度為：Urel7=1.1%/=0.00635。

2.8 合成標準不確定度Ux

綜上，實驗過程中，影響檢驗結果的各個因素引入的相對不確定度，見表5。各個因素引入的相對不確定度占比，見圖2。

圖2 各測量不確定度的占比統計圖Fig.2 Statistical chart of the proportion of measurement uncertainty

表5 相對不確定度一覽表Table 5 List of relative uncertainty

由表5 可知，相對不確定度Urel為：

根據1.2.4 數學模型、醬油樣品的測試結果，醬油樣品進樣液中三氯蔗糖峰面積對應的濃度C=0.0960 mg/mL，醬油樣品定容體積V=1 mL，醬油樣品取樣量m=2.003 g，則三氯蔗糖的平均含量為X=0.047928108 g/kg。合成標準不確定度Ux=Urel×X=0.0706 ×0.047928108=0.003383724 g/kg。

2.9 醬油樣品中三氯蔗糖的檢測結果

2.9.1 擴展標準不確定度U 相對擴展不確定度為U=Ux×k=0.003383724 ×2=0.006767449 g/kg（k=2，P=95%）。

2.9.2 不確定度評估報告 高效液相色譜法檢測醬油樣品中食品添加劑三氯蔗糖的含量：當k=2 時，X±U=（0.048±0.007）g/kg。

3 討論

分析在實驗過程中，利用食品安全國家標準GB 22255-2014《食品安全標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》[29]檢測三氯蔗糖含量，結合國家計量技術規范JJF 1059.1-2012[33]、國家計量技術規程JJG 196-2006[31]要求對檢測結果評估，分析不確定度的主要來源。通過對醬油樣品重復測定，三氯蔗糖標準品，醬油樣品稱量，三氯蔗糖標準品純度，三氯蔗糖標準品建立的標準曲線，三氯蔗糖標準品溶液配制過程中所使用的玻璃器具，加入標準溶液后的回收率，測量三氯蔗糖含量的液相色譜儀對檢測結果不確定度進行評定。

根據圖2 可知，三氯蔗糖含量檢測過程進行不確定度評定主要影響因素為：三氯蔗糖標準品建立的標準曲線擬合，占比約為67%；其次為回收率，占比約為17%；其他因素共占比約為16%（其中：醬油樣品重復測定約0.1%，三氯蔗糖標準品、醬油樣品稱量約2.8%，三氯蔗糖標準品純度約2.9%，三氯蔗糖標準品溶液配制過程中所使用的玻璃器具約4.4%，測量三氯蔗糖含量的高效液相色譜儀約6.2%）。因此，為了降低檢測三氯蔗糖含量過程的不確定度，應該從以下方面考慮：a.測定醬油樣品前期，應該做預實驗，設定多個三氯蔗糖標準溶液濃度范圍，初步選擇醬油樣品中所含三氯蔗糖濃度大致范圍；依據所選范圍設定合適的濃度點再精細測定醬油樣品中三氯蔗糖的濃度。b.通過調整三氯蔗糖標準溶液標準曲線的權重，提高濃度低含量時的準確性。c.在測定過程中，操作人員應該注意醬油樣品前處理，提高樣品的回收率。d.實驗中高效液相色譜儀帶來的不確定度可以通過做好儀器保養、期間核查、定時檢定校準，從而降低不確定度。e.針對三氯蔗糖標準品配制過程中所使用的玻璃器具帶來的不確定度，可以通過配制三氯蔗糖標準溶液標準曲線時選用高級別的容量瓶和單線標的刻度吸管，從而提高檢測準確性。f.人員在實驗過程中，嚴格按照國家標準操作，同時，可以增加醬油樣品、三氯蔗糖標準溶液測定次數從而降低不確定度。g.對于三氯蔗糖標準品帶來的不確定度，可能三氯蔗糖標準品中存在其他雜質，賦與三氯蔗糖標準品的值與實際三氯蔗糖標準品的值存在偏差，可以通過選擇購買純度更高的三氯蔗糖標準品，降低由三氯蔗糖標準品帶來的不確定度。

4 結論

本文建立了高效液相色譜法測定醬油樣品中三氯蔗糖的含量不確定度的評定方法，最終確定醬油樣品中三氯蔗糖的含量測定結果的不確定度來源主要有兩部分：三氯蔗糖標準溶液建立的標準曲線的擬合（占比約為67%）、回收率（占比約為17%），明確檢測醬油樣品中三氯蔗糖含量過程中帶來的各種不確定度評定因素的占比，并且進行了分析、提出了改進的方法，有助于依據食品安全國家標準GB 22255-2014《食品安全標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》檢測過程中，降低檢測各個過程中引入不確定度帶來的風險，提高了檢測的準確性，也為檢測過程中質量控制提供了參考依據。

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