響應(yīng)面法優(yōu)化魔芋葡甘聚糖的純化工藝

包芮寧，吳衛(wèi)國(guó)，廖盧艷，王 燕

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

魔芋是一種多年生草本植物，主要生長(zhǎng)在位于亞洲東南部亞熱帶的山區(qū)或丘陵地帶[1]，在我國(guó)廣泛種植于陜西、甘肅以及云、貴、川等地，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物[2-3]。魔芋中含有不溶性淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)以及脂類[4]，其主要食用部位是球狀塊莖。魔芋葡甘聚糖（Konjac Glucommannan，KGM）作為球狀塊莖中占比最多的成分，含量可達(dá)到50%以上[5-6]，KGM 含量也常用作評(píng)價(jià)魔芋粉質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)[7]。

KGM 由葡萄糖和甘露糖結(jié)合構(gòu)成[8-9]，可作為天然的食品防腐劑用于防止食品變質(zhì)以及蟲害[10]，也能夠預(yù)防多種慢性疾病，包括降低血糖、膽固醇、甘油三酯和血壓水平[11]等，還能通過(guò)調(diào)節(jié)新陳代謝、改善胃腸道環(huán)境、增加有益菌、增強(qiáng)飽腹感以達(dá)到減肥的目的[12-13]，現(xiàn)已被應(yīng)用于臨床醫(yī)藥等領(lǐng)域[14-15]。此外KGM 還具有水溶性好、膠凝性極佳、生物可降解性強(qiáng)等諸多優(yōu)良特性[16-17]，許多文獻(xiàn)也報(bào)道過(guò)其在食品包裝膜方面的進(jìn)展[18-20]，已被引入許多國(guó)家用作食品添加劑和膳食補(bǔ)充劑，在食品、醫(yī)藥、化工[21-24]等領(lǐng)域均具有很好的應(yīng)用價(jià)值，因此提高KGM 含量的研究對(duì)研發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。

目前KGM 的純化方法大致包括乙醇沉淀法、生物酶法、Pb（AC）2法等，但存在引入重金屬離子、KGM 得率較低、操作復(fù)雜且效率低下等問(wèn)題，限制其應(yīng)用于食品產(chǎn)業(yè)加工[25-26]。由于KGM 具有易溶于水而不溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)[27]，本研究采用超聲波輔助乙醇沉淀法進(jìn)行純化[28]，運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)出魔芋粉中KGM 的最優(yōu)純化條件，測(cè)定得率，并通過(guò)傅立葉紅外光譜儀（FT-IR）和X 射線衍射儀（XRD）對(duì)其優(yōu)化前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以期為KGM 的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)和思路借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魔芋粉 湖南省好味屋食品有限公司；硫酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、溴化鉀 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 中國(guó)氪道試劑公司；DNS 顯色液 中國(guó)飛凈生物科技有限公司。

1510-02624 全波長(zhǎng)高速酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司；101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；S-LC 電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BS224S 電子天平

賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；KH-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；LD5-2A 離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；IRAffinity-1 傅立葉紅外光譜儀、XRD-6000 型X 射線衍射儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別移取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 的1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于6 個(gè)25 mL 具塞試管中并用蒸餾水補(bǔ)至2 mL，加入1.5 mL DNS，100 ℃水解5 min，冷卻后定容。移取樣液于酶標(biāo)板，在540 nm 處測(cè)其吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.3589X+0.0006（R2=0.9945），可見葡萄糖含量在0～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.2.2 魔芋粉中KGM 含量的測(cè)定 魔芋粉的純化[26]：稱取1 g 魔芋粉加入乙醇溶液，攪拌均勻后在一定的超聲溫度、功率和時(shí)間下進(jìn)行純化，過(guò)濾后稱取0.1900～0.2000 g 濾渣加入蒸餾水，溶脹3 h 后于離心機(jī)轉(zhuǎn)速4000 r/min 下離心20 min，上清液即為提取液。

KGM 含量的測(cè)定參照NY/T 494-2010 魔芋粉標(biāo)準(zhǔn)附錄A[29]。根據(jù)公式（1）計(jì)算其含量。

魔芋粉中KGM含量(以干基計(jì),%)=

式中：ε為KGM 水解前后葡萄糖和甘露糖殘基的分子量之比，ε=0.9；T 為KGM 水解液的葡萄糖含量，單位為毫克（mg）；T0為KGM 提取液的葡萄糖含量，單位為毫克（mg）；m 為魔芋粉樣品質(zhì)量，單位為克（g）；w 為樣品含水量，%。1.2.3 魔芋粉中KGM 得率的測(cè)定 根據(jù)公式（2）計(jì)算KGM 得率[30]。

式中：KGM 質(zhì)量與魔芋粉質(zhì)量，單位均為毫克（mg）。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 料液比對(duì)KGM 含量的影響 準(zhǔn)確稱量魔芋粉每份1.0 g，將乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間以及超聲功率分別設(shè)定為80%、50 ℃、45 min、200 W，料液比分別調(diào)為1:40、1:60、1:80、1:100、1:120（g/mL），在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察料液比對(duì)其含量的影響。

1.2.4.2 乙醇濃度對(duì)KGM 含量的影響 準(zhǔn)確稱量魔芋粉每份1.0 g，將料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間以及超聲功率分別設(shè)定為1:100（g/mL）、50 ℃、45 min、200 W，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察乙醇濃度對(duì)其含量的影響。

1.2.4.3 超聲溫度對(duì)KGM 含量的影響 準(zhǔn)確稱量魔芋粉每份1.0 g，將乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間以及超聲功率分別設(shè)定為70%、1:100（g/mL）、45 min、200 W，超聲溫度在30、40、50、60、70 ℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察超聲溫度對(duì)其含量的影響。

1.2.4.4 超聲功率對(duì)KGM 含量的影響 準(zhǔn)確稱量魔芋粉每份1.0 g，將乙醇濃度、料液比、超聲溫度以及超聲時(shí)間分別設(shè)定為70%、1:100（g/mL）、50 ℃、45 min，超聲功率分別為125、150、175、200、225 W，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察超聲功率對(duì)其含量的影響。

1.2.4.5 超聲時(shí)間對(duì)KGM 含量的影響 準(zhǔn)確稱量魔芋粉每份1.0 g，將乙醇濃度、料液比、超聲溫度以及超聲功率分別設(shè)定為70%、1:100（g/mL）、50 ℃、175 W，超聲時(shí)間分別為15、30、45、60、75 min，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察超聲功率對(duì)其含量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，排除對(duì)含量影響不顯著（P＞0.05）的因素，選擇料液比、乙醇濃度和超聲時(shí)間的相關(guān)水平進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以確定最優(yōu)條件，具體試驗(yàn)水平參照表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor level design of response surface test

1.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 FT-IR 測(cè)定 將樣品與溴化鉀烘干，按質(zhì)量比1:50 混合研磨，壓片后放入紅外光譜儀，在波數(shù)范圍4000～500 cm-1，分辨率4 cm-1下測(cè)定[31]。

1.3.2 XRD 測(cè)定 將樣品置于載玻片壓片，放入X 射線衍射儀測(cè)試。測(cè)試條件：室溫，管壓40 kV，電流40 mA，2θ掃描范圍4°～40°，速率2°/min 條件下進(jìn)行[32]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次平行，結(jié)果用平均值表示。運(yùn)用IBS SPSS Statistics 26 進(jìn)行單因素顯著性分析，Origin2022 軟件進(jìn)行圖形繪制，Design-Expert 13.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 料液比對(duì)KGM 含量的影響 如圖1 所示，料液比較少時(shí)，魔芋粉中大分子物質(zhì)難以解聚溶出，KGM 的含量因此較低[33]。隨著料液比的增大，乙醇量相對(duì)增多，KGM 含量逐漸升高。當(dāng)料液比為1:100（g/mL）時(shí)，KGM 含量達(dá)到最大值77.88%后逐漸下降。因?yàn)槠湓谝掖剂肯鄬?duì)較多的情況下發(fā)生過(guò)度溶脹，包埋大量水分[34]，過(guò)多水溶劑的存在導(dǎo)致部分KGM 溶解于水中，含量在此情況下開始下降。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，料液比對(duì)KGM 含量的影響有顯著差異（P＜0.05），其中料液比為1:100（g/mL）時(shí)極顯著，選取料液比1:80、1:100、1:120（g/mL）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 料液比對(duì)KGM 含量的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the content of KGM

2.1.2 乙醇濃度對(duì)KGM 含量的影響 如圖2 所示，魔芋粉加入乙醇溶液后，其中的KGM、蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)溶于水，在乙醇濃度較低的條件下，KGM所受到的沉淀作用較小，而且其中一部分可能會(huì)溶解到水溶劑中流失，導(dǎo)致含量較低[30]。而隨著乙醇濃度增長(zhǎng)至70%時(shí)，KGM 含量達(dá)到了最大值為83.41%。乙醇濃度繼續(xù)增大，抑制KGM 分子的伸展，不能有效地將其包裹、結(jié)合的雜質(zhì)釋放，導(dǎo)致含量降低[35]。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乙醇濃度對(duì)KGM 含量的影響有顯著差異（P＜0.05），其中乙醇濃度70%時(shí)極顯著，選取乙醇濃度60%、70%、80%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對(duì)KGM 含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the content of KGM

2.1.3 超聲溫度對(duì)KGM 含量的影響 圖3 所示，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，含量達(dá)到最大值81.24%。這是由于溫度較低時(shí)，魔芋粉中大分子物質(zhì)結(jié)合較為緊密，升溫使得分子從魔芋粉中擴(kuò)散的速率提高[33]，超聲溫度繼續(xù)升高，可能會(huì)導(dǎo)致KGM 分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，含量有所下降。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，超聲溫度對(duì)KGM 含量的影響沒有顯著差異（P＞0.05）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中超聲溫度固定為50 ℃。

圖3 超聲溫度對(duì)KGM 含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the content of KGM

2.1.4 超聲功率對(duì)KGM 含量的影響 如圖4 所示，功率過(guò)小影響了超聲波對(duì)魔芋粉的破壞作用，未能完全打開分子鏈，使雜質(zhì)不能有效溶出，因此KGM 含量較低。隨著超聲功率達(dá)175 W，含量達(dá)到了最大值82.26%。隨著功率繼續(xù)增大，在空化作用下多糖分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞壁破碎加劇，導(dǎo)致KGM 含量逐漸減少[5,31]。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，超聲功率對(duì)KGM 含量的影響沒有顯著差異（P＞0.05）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中超聲功率固定為175 W。

圖4 超聲功率對(duì)KGM 含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the content of KGM

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)KGM 含量的影響 由圖5 可知，隨超聲時(shí)間達(dá)到60 min，KGM 含量逐漸升高至88.75%，隨后下降。因?yàn)樵诔晻r(shí)間較短的條件下，KGM 與其他分子物質(zhì)結(jié)合緊密，分子鏈未能完全打開，雜質(zhì)也未能完全釋放。而長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用又使KGM 的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，空化作用導(dǎo)致分子鏈遭到破壞[5,31]，KGM 含量因此下降。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，超聲時(shí)間對(duì)KGM 含量的影響有顯著差異（P＜0.05），其中超聲時(shí)間為60 min 時(shí)極顯著，選取超聲時(shí)間45、60、75 min 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)KGM 含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the content of KGM

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

參考Box-Behnken 原理，優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

根據(jù)表2 中的數(shù)據(jù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果回歸擬合，得到模型對(duì)應(yīng)的回歸方程為：Y=88.22-1.8A+6.41B-2.21C-0.22AB+1.98AC-0.48BC-13.19A2-13.59B2-6.77C2，對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

由表3 結(jié)果分析可知，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.2003），且本試驗(yàn)所采用的回歸模型是極顯著水平（P＜0.01），因此該模型可取。R2adj=0.9872，意味著該模型可信度較高。一次項(xiàng)B 差異極顯著（P＜0.01），A、C 差異顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)含量的影響極顯著（P＜0.01）；各試驗(yàn)條件下三個(gè)因素影響KGM 含量的程度大小為：乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞料液比。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面交互效應(yīng)圖，如圖6～圖8 所示。

圖6 料液比、乙醇濃度交互項(xiàng)對(duì)KGM 含量的影響Fig.6 Influence of material-liquid ratio and ethanol concentration interaction on the content of KGM

圖6 響應(yīng)面圖可以看出，乙醇濃度比料液比的坡度稍陡峭，結(jié)合等高線圖，乙醇濃度軸向的等高線較密集，表明與料液比相比，乙醇濃度的影響稍顯著。較橢圓形的等高線圖和陡峭的響應(yīng)面圖，說(shuō)明了料液比和乙醇濃度具有交互效應(yīng)。在不改變超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率的條件下，隨料液比的增加和乙醇濃度的升高，KGM 含量會(huì)先升高達(dá)到峰值后再減小。

圖7 響應(yīng)面圖可以看出，超聲時(shí)間比料液比的坡度更為陡峭，結(jié)合等高線圖，超聲時(shí)間軸向的等高線更加密集，表明超聲時(shí)間對(duì)KGM 含量的影響更為顯著。橢圓形的等高線圖和陡峭的響應(yīng)面圖，說(shuō)明了料液比和超聲時(shí)間的交互作用較強(qiáng)。在不改變乙醇濃度、超聲溫度和超聲功率的條件下，隨料液比的增加和超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，KGM 含量會(huì)先升高達(dá)到峰值后再減小。

圖7 料液比、超聲時(shí)間交互項(xiàng)對(duì)KGM 含量的影響Fig.7 Influence of material-liquid ratio and ultrasonic time interaction on the content of KGM

圖8 所示響應(yīng)面圖可以看出，乙醇濃度比超聲時(shí)間更陡峭，結(jié)合等高線圖，乙醇濃度軸向的等高線更密集，表明與超聲時(shí)間相比，乙醇濃度對(duì)KGM 含量的影響更顯著。橢圓形的等高線圖和陡峭的響應(yīng)面圖，說(shuō)明了乙醇濃度和超聲時(shí)間交互效應(yīng)較強(qiáng)。在不改變其他條件的基礎(chǔ)上，超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和乙醇濃度的升高會(huì)使KGM 含量先升高達(dá)到峰值后再減小。

圖8 乙醇濃度、超聲時(shí)間交互項(xiàng)對(duì)KGM 含量的影響Fig.8 Influence of ethanol concentration and ultrasonic time interaction on the content of KGM

利用Design-Expert 軟件得出，魔芋粉最佳純化條件是料液比1:101.538（g/mL），乙醇濃度72.777%，超聲時(shí)間為54.808 min，KGM 含量可達(dá)88.672%。根據(jù)實(shí)際操作進(jìn)行修整，料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間分別為1:102（g/mL）、73%和55 min，通過(guò)三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到KGM 含量為88.1%±1.05%，與預(yù)測(cè)值較為接近，說(shuō)明優(yōu)化模型是合理可行的。

經(jīng)公式（1）計(jì)算純化前KGM 含量為59.70%±0.97%，純化后含量為88.1%±1.05%；經(jīng)公式（2）計(jì)算純化前KGM 得率為52.24%±1.29%，純化后得率為62.93%±1.73%。因此，工藝優(yōu)化后KGM 含量與得率均顯著提高。

2.3 結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 FT-IR 圖譜分析 為了解純化前后官能團(tuán)的變化情況，采用傅里葉紅外光譜儀對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行探測(cè)[36]，如圖9 紅外圖譜所示，吸收峰的形狀以及出現(xiàn)位置大致相同，未出現(xiàn)新的吸收峰，這與所報(bào)道的結(jié)果一致[37]。KGM 中-OH 的伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在3000～3700 cm-1之間，這是多糖的特征峰[38]。在2800～3000 cm-1范圍內(nèi)的峰由-CH3和-CH2基團(tuán)中的-CH 鍵拉伸所產(chǎn)生。在1647 cm-1處的吸收帶代表分子內(nèi)氫鍵的特征峰。

圖9 純化前后KGM 的傅里葉紅外光譜圖Fig.9 FT-IR spectrum of KGM before and after purification

2.3.2 XRD 圖譜分析 如圖10 所示，純化前后KGM的XRD 圖譜在2θ處于4°～40°間均未表現(xiàn)出明顯的結(jié)晶峰，在2θ處于20°左右時(shí)均出現(xiàn)一個(gè)較寬的彌散峰，與報(bào)道所述一致[39]。此外，沒有觀察到新的特征峰的出現(xiàn)，說(shuō)明純化工藝對(duì)KGM 結(jié)構(gòu)、結(jié)晶度以及氫鍵作用力的影響微弱[39]。

圖10 純化前后KGM 的X 射線衍射圖Fig.10 X-ray diffraction pattern of KGM before and after purification

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定魔芋粉最佳純化工藝條件：超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比、超聲溫度和超聲功率分別為55 min、73%、1:102（g/mL）、50 ℃、175 W，該條件下KGM 含量與模型預(yù)測(cè)值相差較小，達(dá)到88.1%±1.05%。經(jīng)計(jì)算該工藝條件下KGM 得率為62.93%。隨后對(duì)其優(yōu)化前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，對(duì)比兩者的FT-IR 圖譜和XRD 圖譜，未發(fā)現(xiàn)明顯差異，證明該優(yōu)化工藝對(duì)KGM 結(jié)構(gòu)影響較弱。因此在不改變KGM 結(jié)構(gòu)的前提下，應(yīng)用該工藝可以更加低廉、高效、無(wú)損地對(duì)魔芋粉進(jìn)行純化，得到純度更高的KGM，為其應(yīng)用于食品藥品等行業(yè)加工生產(chǎn)提供基礎(chǔ)理論和研究方向。

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