不同生長時(shí)期酸棗果肉多糖相對分子質(zhì)量分布和單糖組成及抗氧化活性研究

王 磊，李國龍，唐志書,,3,*，宋忠興，袁書會，劉紅波，史鑫波，陳佳昕

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春 130117；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西咸陽 712083；3.中國中醫(yī)科學(xué)院研究生院，北京 100700）

酸棗（Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu.ex H.F.Chou）為鼠李科棗屬落葉小喬木，其種子酸棗仁具有養(yǎng)心補(bǔ)肝，寧心安神等功效，是中醫(yī)藥臨床治療失眠的首選品，酸棗果肉為酸棗仁生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品。酸棗果肉含有多種化學(xué)成分[1]，如多糖、有機(jī)酸、多酚、甾醇、黃酮以及多種微量元素和大量維生素等，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌和保肝活性[2-5]。據(jù)報(bào)道約每30 kg 酸棗鮮果僅可產(chǎn)出酸棗仁藥材1 kg[6]，僅少量酸棗果肉作食品應(yīng)用，如酸棗汁、酸棗糕、酸棗面等[7-9]。每年有大量的酸棗果肉作為廢棄組織被丟棄，造成極大的資源浪費(fèi)，導(dǎo)致酸棗的資源利用率低下。

近年來，隨著人們對健康生活的向往以及養(yǎng)生觀念的提高，多糖的保健作用引起人們的廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)很多植物多糖具有抗菌、抗氧化和保肝等多種生物活性[10-12]。隨著對植物多糖的研究逐步深入，發(fā)現(xiàn)在器官水平、細(xì)胞水平到分子水平，均有不同程度的免疫調(diào)節(jié)作用[13]；同時(shí)發(fā)現(xiàn)多種植物多糖具有抗氧化活性[14-16]，目前已有80 多種植物多糖被成功提取并有望廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品的研究和開發(fā)中[17]。植物多糖的結(jié)構(gòu)是影響其生物活性的關(guān)鍵因素，確定多糖的一級結(jié)構(gòu)能夠清楚地了解其生物活性及其機(jī)制[18]。

雖然現(xiàn)今藥食同源類中藥多糖在功能性保健食品方面應(yīng)用較少，但以藥食同源類中藥多糖為天然原料研發(fā)功能性保健食品具有巨大潛力[19]。酸棗果肉中含有豐富的多糖，有研究報(bào)道酸棗果肉中多糖有增強(qiáng)小鼠的肌力、記憶力、食欲等作用[20-21]。有研究表明植物多糖的生物活性和營養(yǎng)價(jià)值與其生長過程中的含量、相對分子質(zhì)量及單糖組成密切相關(guān)[22-23]。目前，對酸棗果肉中多糖相關(guān)研究大多針對其提取方式和生物活性[24-25]，而有關(guān)生長過程中酸棗果肉中多糖含量、相對分子質(zhì)量、單糖組成等初級結(jié)構(gòu)及抗氧化活性變化規(guī)律尚未見報(bào)道，本研究通過對不同時(shí)期野生型和種植型酸棗果肉多糖（Ziziphus jujubaflesh polysaccharide，ZJFP）進(jìn)行多糖含量、抗氧化能力、相對分子質(zhì)量和單糖組成進(jìn)行研究分析，探究酸棗果肉中多糖含量及其單糖組成變化、抗氧化活性在不同生長時(shí)期的變化規(guī)律，以期為進(jìn)一步研究酸棗果肉多糖結(jié)構(gòu)與其功能活性的關(guān)系和抗氧化功能食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗樣品 采自陜西咸陽淳化縣北仲山酸棗種植基地（N34°45'36''，E108°30'6''），經(jīng)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心宋忠興主任藥師鑒定為鼠李科棗屬植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的果實(shí)，本次研究選取基地外野生和基地內(nèi)種植的不同生長時(shí)期的酸棗，共采摘五次共十批樣品，分別為7 月7 日、8 月7 日、9 月7 日、9 月25 日、10 月7 日采摘的鮮果；三氟乙酸、葡萄糖對照品、巖藻糖對照品、鼠李糖對照品、阿拉伯糖對照品、半乳糖對照品、木糖對照品、甘露糖對照品、核糖對照品、葡萄糖醛酸對照品Sigma 公司；甘露糖醛酸對照品 南通飛宇生物科技有限公司；普魯蘭DXT3K、普魯蘭DXT21K、普魯蘭DXT130K、普魯蘭DXT600K、普魯蘭DXT 820K、普魯蘭DXT3755K、1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、半乳糖醛酸對照品、古羅糖醛酸對照品上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；水 為純化水。

ICS5000 離子色譜、Thermo Multiskan GO 多功能酶標(biāo)儀、Forma 88000 超低溫冰箱、Reacti-thermo 氮?dú)獯祾邇x、U3000 凝膠色譜 美國Thermo 公司；OPTILAB T-rex 示差檢測器 美國Wyatt 公司；UV-2600 紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Sartorius CPA225D 十萬分之一電子分析天平 德國賽多利斯公司；SRA12N60 冷凍干燥機(jī) 上海舍巖儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗果肉粗多糖提取 酸棗樣品自然陰干，除去果核，得到酸棗果肉。然后精密稱取干燥至恒重的酸棗果肉細(xì)粉0.25 g，置圓底燒瓶中，加入80%乙醇150 mL，加熱回流1 h，趁熱過濾，留殘?jiān)瑲堅(jiān)?0%熱乙醇洗滌3 次，每次10 mL，將殘?jiān)盀V紙置于燒瓶中，加入150 mL 水，加熱回流1 h，趁熱過濾，留濾液，殘?jiān)盁坑脽崴礈? 次，每次10 mL，合并濾液及洗液，濃縮，-80 ℃冰箱預(yù)凍12 h，于冷凍干燥機(jī)-60 ℃條件下干燥24 h，得酸棗果肉粗多糖[26]。

1.2.2 總多糖含量測定 參照查娜等[27]酸棗果肉多糖含量測定方法，配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的無水葡萄糖對照品溶液，使用苯酚-硫酸法進(jìn)行顯色，在490 nm 波長處測定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0167x-0.0015（R2=0.9991）。x 為葡萄糖質(zhì)量濃度，y 為吸光度。

1.2.3 ZJFP 相對分子質(zhì)量分布測定

1.2.3.1 多糖對照品溶液配制 取不同規(guī)格的普魯蘭多糖適量[26]，精密稱定，用0.1 mol/L NaNO3水溶液（含0.02% NaN3，w/w）溶解，配成平均相對分子質(zhì)量（Mw）為6.10×105Da 的對照品溶液（A），Mw 分別為2.10×104、3.75×106Da 的對照品混合溶液（B）和Mw 為3.65×103、1.31×104、8.21×105Da 的對照品混合溶液（C），定容至濃度為1.0 mg/mL。

1.2.3.2 高效凝膠色譜分析 稱取適量“1.2.1”項(xiàng)下多糖溶解在0.1 mol/L NaNO3水溶液（含0.02%NaN3，w/w）中，配制終濃度為1.0 mg/mL 的多糖溶液，并通過孔徑為0.45 μm 的過濾器過濾后上機(jī)檢測[28]。采用凝膠排阻色譜柱（Ohpak SB-805 HQ、Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-803 HQ，300 mm×8 mm）串聯(lián)。柱溫45 ℃，進(jìn)樣量100 μL，流動相A（0.02% NaN3，0.1 mol/L NaNO3），流速0.5 mL/min，洗脫梯度為等度，洗脫時(shí)間為100 min。

將多糖對照品溶液進(jìn)行分析，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，示差信號值為縱坐標(biāo)。以l g（Vh）流體力學(xué)體積為縱坐標(biāo)（y），洗脫體積Vel 為橫坐標(biāo)（x），得線性回歸方程為y=-0.8158x+15.233（R2=0.9946），計(jì)算ZJFP的Mw。

1.2.4 ZJFP 中的單糖組成種類及含量測定

1.2.4.1 ZJFP 完全酸水解物的制備 取干凈的色譜瓶，稱取適量多糖樣品，加入1 mL 2.0 mol/L 三氟乙酸溶液，121 ℃加熱2 h[29]。通氮?dú)猓蹈伞＜尤爰状记逑矗俅蹈桑貜?fù)甲醇清洗2～3 次。加入水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測。

1.2.4.2 單糖對照品溶液配制 準(zhǔn)確稱取所需標(biāo)準(zhǔn)品后，加水配成10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液母液單標(biāo)，然后取適量標(biāo)準(zhǔn)品母液單標(biāo)混合配制成最高指標(biāo)濃度為60、50、40 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)，根據(jù)需要將其稀釋1.25、1.66、2.5、5、10、50、100 倍。

1.2.4.3 離子色譜分析條件 根據(jù)文獻(xiàn)[30]，采用Dionex? CarboPac? PA20（150 mm×3.0 mm，10 μm）液相色譜柱；進(jìn)樣量為5 μL。流動相A（H2O），流動相B（0.1 mol/L NaOH），流動相C（0.1 mol/L NaOH，0.2 mol/L NaAc），流速0.5 mL/min；柱溫為30 ℃；洗脫梯度：0 min A 相/B 相/C 相（95:5:0，V/V/V），26 min A 相/B 相/C 相（85:5:10，V/V/V），42 min A 相/B 相/C 相（85:5:10，V/V/V），42.1 min A 相/B 相/C 相（60:0:40，V/V/V），52 min A 相/B 相/C 相（60:40:0，V/V/V），52.1 min A 相/B 相/C 相（95:5:0，V/V/V），60 min A 相/B 相/C 相（95:5:0，V/V/V）。

1.2.5 不同生長時(shí)期ZJFP 的DPPH 自由基清除能力測定 取不同時(shí)期ZJFP 干品，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的多糖溶液。取多糖2.0 mL，加入2.0 mL 濃度為0.02 mol/mL 的現(xiàn)配DPPH 乙醇溶液，混合均勻，于37 ℃下避光反應(yīng)30 min，測定517 nm 處吸光度[31]。VC作陽性對照。按公式計(jì)算DPPH 自由基清除能力。以乙醇代替DPPH 溶液為對照組A0，水替代樣品作空白組AP，多糖樣品組為AS。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品進(jìn)行3 次測定，顯著性差異采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Origin 2019b 對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖分析，色譜數(shù)據(jù)利用軟件Chromeleon 處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期酸棗果肉中多糖含量

對采集的酸棗果肉進(jìn)行多糖含量測定，結(jié)果見圖1。野生型ZJFP 的含量為44.01±2.18～66.05±0.98 mg/g；種植型ZJFP 含量為41.08±2.27～59.66±2.97 mg/g，酸棗果肉中多糖含量與生長期密切相關(guān)，生長前期酸棗膨大消耗多糖，中期果實(shí)大小穩(wěn)定后多糖開始積累。野生型ZJFP 在7 月7 日至8 月7 日之間含量顯著下降（P＜0.05），在8 月7 日至10 月7 日之間進(jìn)行積累；種植型ZJFP 在7 月7 日至9 月7 日之間含量顯著下降（P＜0.05），在9 月7 日至10 月7 日之間進(jìn)行積累。

圖1 不同時(shí)期和種植方式ZJFP 含量Fig.1 ZJFP content in different stages and different planting methods

2.2 ZJFP 相對分子質(zhì)量分布

將多糖對照品溶液進(jìn)行分析，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，示差信號值為縱坐標(biāo)，結(jié)果見圖2。將ZJFP 溶液在1.2.3 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，根據(jù)保留時(shí)間可以將ZJFP 分為P1、P2、P3、P4 四個(gè)組分，其中P1、P2 峰面積較大，保留時(shí)間較長，平均Mw 分別為5.23×106、10.03×104Da；P3、P4 峰面積較小，保留時(shí)間較短，平均Mw 分別為2.03×102、0.39×102Da，見圖3。

圖2 普魯蘭多糖對照品高效凝膠色譜圖Fig.2 High performance gel chromatogram of Pullulan reference substance

圖3 不同時(shí)期ZJFP 高效凝膠色譜圖Fig.3 High performance gel chromatogram of ZJFP at different stages

隨著酸棗果實(shí)的生長，野生型ZJFP 的P1、P4兩個(gè)組分含量逐步降低，P3 組分先降低后穩(wěn)定，P2 組分占比逐漸增大；種植型ZJFP 的P1 和P4 兩個(gè)組分的含量逐步降低，P3 組分含量先升高后降低、P2 組分含量逐步升高。隨著酸棗的成熟，果肉多糖中相對分子量較大的P1 組分逐漸消耗，P2 組分占比增大的相對分子質(zhì)量發(fā)生變化，種植型ZJFP 相對分子質(zhì)量為4.46×105～5.84×106Da，野生型ZJFP相對分子質(zhì)量為6.90×105～6.12×106Da，見表1。

表1 不同時(shí)期ZJFP 相對分子質(zhì)量Table 1 Relative molecular weight of ZJFP in different stages

2.3 ZJFP 中的單糖組成及含量分析

將“1.2.4”下制備的多糖酸水溶液采用離子色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，通過對比標(biāo)準(zhǔn)單糖圖譜可知，兩種類型ZJFP 酸水解液均有9 種單糖共有峰，按保留時(shí)間依次鑒定為巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸，見圖4。酸棗果肉多糖的單糖組成數(shù)據(jù)處理時(shí)，采用外標(biāo)法定量，測定不同濃度標(biāo)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系信息見表2。

表2 各單糖標(biāo)曲信息Table 2 Standard curve information of each monosaccharide

圖4 單糖對照品（A）及酸棗果肉多糖（B）中各單糖組成離子色譜圖Fig.4 Ion chromatogram of sugar components in monosaccharide control sample (A) and ZJFP (B)

根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中巖藻糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸的含量。種植型ZJFP 中9 種單糖平均含量分別是0.93、0.94、35.09、36.68、25.25、29.86、5.36、4.25、23.41 mg/g，野生型ZJFP 中9 種單糖平均含量分別是1.06、1.06、36.72、43.73、29.27、23.57、5.90、3.66、33.86 mg/g。從圖5 中可以看出，兩種類型ZJFP 中9 種單糖平均含量最高的是鼠李糖，其次是阿拉伯糖，其中巖藻糖與葡萄糖醛酸含量基本相同，所占比例僅0.4%。兩種類型酸棗在發(fā)育過程中阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、巖藻糖和葡萄糖醛酸五種單糖在多糖中占比增大，鼠李糖、半乳糖、木糖和甘露糖在多糖中占比減少。野生型ZJFP 中半乳糖醛酸占比高達(dá)25.00%、葡萄糖醛酸占比也可到1.08%；種植型ZJFP 中半乳糖醛酸占比則為16.26%，葡萄糖醛酸占比為0.64%。種植型酸棗相對與野生型酸棗其ZJFP 中葡萄糖占比較大，可達(dá)22.51%，野生型僅為14.10%。

圖5 不同時(shí)期ZJFP 中各單糖的含量變化Fig.5 Changes in the content of polysaccharides and monosaccharides in ZJFP at different stages

2.4 不同生長時(shí)期ZJFP 的DPPH 自由基清除能力測定

從圖6 中可以看出，ZJFP 濃度為1.0 mg/mL時(shí)，野生型ZJFP 的DPPH 自由基清除率為41.80%～65.36%，在7 月7 日至8 月7 日顯著下降（P＜0.05），從65.36%降至41.80%，8 月7 日至9 月7 日之間顯著上升（P＜0.05），自41.80%升至52.46%，9 月7 日至10 月7 日，清除能力無顯著變化（P＞0.05）；種植型ZJFP 的DPPH 自由基清除率在47.40%～60.25%，于7 月7 日至8 月7 日之間顯著下降（P＜0.05），自60.25%降至47.40%，8 月7 日至10 月7 日間，清除能力無顯著變化（P＞0.05）。對不同時(shí)期ZJFP 含量與DPPH 自由基清除能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期ZJFP 含量與其DPPH 自由基清除能力顯著相關(guān)（P＜0.01），見表3。

表3 ZJFP 含量和DPPH 自由基清除率相關(guān)性Table 3 Correlation between ZJFP content and DPPH radical scavenging rate

圖6 不同時(shí)期ZJFP 的DPPH 清除能力Fig.6 DPPH scavenging capability of ZJFP at different stages

3 討論與結(jié)論

本研究對不同時(shí)期酸棗的果肉多糖進(jìn)行含量測定發(fā)現(xiàn)，發(fā)育過程中果肉多糖含量呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，且發(fā)育后期多糖含量低于發(fā)育初期。有研究表明酸棗果實(shí)總糖量顯著低于一些棗類，同時(shí)有機(jī)酸含量顯著高于棗果實(shí)[32]，這可能是酸棗獨(dú)特風(fēng)味的原因。通過對酸棗果肉多糖進(jìn)行相對分子量測定發(fā)現(xiàn)，酸棗果肉多糖可以分為P1（5.23×106Da）、P2（10.03×104Da）、P3（2.03×102Da）和P4（0.39×102Da）四個(gè)組分，P2 組分含量相對較高。單糖組成測定結(jié)果表明兩種類型酸棗果肉多糖均由巖藻糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸9 種單糖組成，與種植型相比野生型酸棗果肉多糖中葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸所占比例相對較高，成熟期酸棗中還原糖類成分，如阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖的含量較果實(shí)發(fā)育初期均出現(xiàn)了明顯增長，表明酸棗屬于還原糖積累類型果實(shí)[33]。DPPH 自由基清除能力測定結(jié)果顯示，當(dāng)ZJFP濃度1.0 mg/mL 時(shí)，野生型ZJFP 平均清除率可達(dá)56.23%，種植型ZJFP 平均可達(dá)51.22%高于相同濃度的板棗多糖[34]、駿棗多糖[35]的清除率，表明兩種類型酸棗果肉多糖具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力。上述研究結(jié)果可為酸棗果肉多糖的開發(fā)和應(yīng)用提供參考，同時(shí)影響抗氧化能力強(qiáng)弱的因素和多糖代謝的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

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