非小細胞肺癌ctDNA 監測耐藥相關伴隨基因研究進展

薛崇祥，張 旭，魯星妤，崔慧娟

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院/國家呼吸醫學中心/國家中西醫結合醫學中心 中西醫結合腫瘤內科，北京 100029）

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因，其中非小細胞 肺 癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）約 占85%［1］。EGFR是NSCLC 患 者 中 最 常 見 的 驅 動 基因，突變頻率可達48%～56%，亞洲女性人群中突變率甚至更高［2］。以表皮生長因子抑制劑（epidermal growth factor receptor inhibitors， EGFRIs）為代表的肺癌靶向藥物，顯著提高了患者的生存獲益［3］。

精準的分子分型是NSCLC 靶向治療的基礎條件，所以準確、可靠的基因檢測方法對靶向用藥的患者篩選及臨床預后監測具有積極意義。EGFR 是最早發現的驅動基因，1990 年首個EGFR 抑制劑苯胺基喹唑啉誕生。2003 年，吉非替尼作為首個小分子EGFR 酪氨酸激酶抑制劑研發成功，并于2005 年在國內上市，肺癌靶向治療時代開啟［4］。同年，“鉆石突變”ALK 融合突變被發現，2010 年首個ALK 抑制劑克唑替尼研發上市，2013 年國內外指南開始推薦將ALK 與EGFR 納入治療前檢測［5］。ROS1 融合基因于2007 年由Rikova 等［4］首次發現，2016 年納入美國臨床實踐指南推薦。后續NSCLC 分子靶點的研究及相應靶向藥物開發不斷推進，越來越多的驅動基因及伴隨基因被發現。按最新指南推薦，肺腺癌患者驅動基因檢測內容已擴展為至少包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、NTRK、MET、HER-2 等基因［6］。

通過對組織樣本或體液標本進行基因檢測，攜帶特定驅動基因的患者可以選擇針對該驅動基因的靶向藥物，并可以科學地預測用藥效果以及副作用。其中，外周血循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）是目前腫瘤液體活檢最主要的標本來源，已成為腫瘤基因檢測的有力手段［7］。有研究表明，放化療等治療方式可能會影響EGFR 突變的狀態，可見肺癌基因檢測結果并非都是一成不變的［8］。因此，初始標本所檢測的基因突變狀態可能不足以預測一線化療后的藥物療效，所以需要動態監測患者的基因突變狀態［8，9］。另一方面，盡管驅動基因陽性NSCLC 患者對特定靶向藥物的客觀緩解率較高，但幾乎所有患者均會出現耐藥。隨著二代測序技術（next-generation sequencing，NGS）的發展，耐藥后的伴隨基因突變檢測對于早期耐藥預警、后續治療指導以及肺癌病人的全程管理和長期獲益具有重要影響。因此，本文就非小細胞肺癌ctDNA 動態監測及耐藥相關伴隨基因研究進展作一綜述。

1 臨床上常見的基因檢測方式

ctDNA 檢測的方法主要包括Sanger 測序、即時定量PCR（qRT-PCR）、NGS 等，各有不同優缺點，需根據檢測內容及臨床需求選擇恰當的檢測方法［10］。

1.1 Sanger 測序法

即雙脫氧鏈末端終止測序法，是最原始的一代基因測序技術。Sanger 測序讀取片段較長，準確度接近100%，早期廣泛應用于EGFR 等基因突變檢測。單次檢測可覆蓋已知少量突變位點，檢測速度快，但如需檢測多位點突變情況需要大量寶貴的樣本多次檢測［11］。另外，Sanger 測序的靈敏度不足，容易產生樣本稀釋甚至污染，已不能滿足現階段臨床基因檢測的現實需求［12］。

1.2 qRT-PCR

qRT-PCR 檢測的基礎是已知基因突變類型設計的引物探針，費用相對低廉，檢測流程和判讀結果簡捷，通過閉管操作改進Sanger 測序擴增產物污染的不足，便于臨床實際開展，于是成為目前基因檢測常用方法之一［13］。雖然靈敏度相對較高，但qRT-PCR 檢測無法檢測出所有可能的突變；對肺癌早期或低DNA 脫落腫瘤細胞狀態患者的基因檢測來說，也仍具有一定挑戰性［14］。

1.3 NGS 技術

NGS 屬于高通量測序技術，靈敏度高，所需檢測樣本量小，以其在DNA 及RNA 水平上可進行多位點、廣深度且同時檢測的優勢，逐步成為肺癌分子病理臨床檢測領域的主流［6］。相較于傳統測序技術，NGS 技術可以檢測重要的未知罕見伴隨突變，涉及多種變異類型，為NSCLC 患者的全程管理提供更加全面可靠的診療依據［15］。而且，NGS 技術還可同時檢測免疫治療相關指標，而且也是目前分子殘留病灶的主要檢測方法，占據臨床診斷與科研熱點前沿［16］。

然而，NGS 并非絕對完美。技術層面上，NGS測序步驟多、程序復雜，讀長較之前的方法更短，后續數據拼接難度增加，且結果的判讀對于生物信息的準確分析具有依賴性。目前，基因檢測市場并不規范，第三方檢測標本缺乏病理科質控而造成結果準確性參差不齊。可及性方面，因NGS 檢測對設備和技術要求較高，故而檢測費用也相對較高，并未全部納入醫保，患者的經濟負擔相對更大，所以還難以全面普及［17］。

2 ctDNA 檢測在NSCLC 診治中的作用及優勢

2.1 ctDNA 檢測可作為組織學檢測的替代或聯合手段

由于相當一部分患者尚無法獲取足夠組織標本，則推薦外周血ctDNA 活檢，以彌補樣本不足和不可及性［6］。在NSCLC 中，外周血ctDNA 檢測能夠較好地反映當前患者的腫瘤負荷與基因突變狀態，已成為組織檢測的有效代替，兩者的臨床指導價值相當［18］。且組織+ctDNA 聯合檢測（35.8%）對比僅單純組織檢測（20.5%）或僅ctDNA 檢測（28.8%），驅動基因檢出率更高［19］。

2.2 ctDNA 檢測可作為早期肺癌患者病理分型及術后復發監測補充

對于早中期肺癌患者，與影像學檢測同時，基于NGS 技術的ctDNA 圖譜在早期NSCLC 病理亞型分類中也具有潛在的應用價值［20］。手術后ctDNA 動態監測在預測復發方面相比于影像學更早，未來甚至或許能發揮蛋白類腫瘤標志物的作用，用于監測肺癌高危患者的腫瘤復發風險［21］。

2.3 ctDNA 檢測可協助預測臨床治療療效

目前肺癌治療的療效評估仍主要依據影像學Recist 或iRecist 標準進行評價，但傳統影像學手段難以預測患者的預后，且存在滯后效應和輻射損傷風險［22，23］。晚期肺癌患者腫瘤負荷更大，初診時外周血ctDNA 濃度一般更高；經治療后其ctDNA 顯著降低，則其對放化療敏感，說明臨床治療有效［24］。但對于局部晚期肺癌患者，倘若治療前ctDNA 就為陰性，可能是腫瘤ctDNA 因位置局限的原因未釋放到血液中，或此時外周血ctDNA 無法反映腫瘤真實狀態。一項真實世界研究［25］驗證了ctDNA 監測對肺癌治療中的療效預測價值，基線ctDNA 狀態與患者總生存期（overall survival， OS）呈負相關，ctDNA清除可作為臨床獲益的預測依據之一。有研究發現［26，27］，相對于常規影像學檢查，ctDNA 監測能夠提前4～9 周時間判斷治療效果，并可能彌補影像學評效的不足，所以ctDNA 監測更具優勢。

3 NGS 檢測在ctDNA 監測中優勢明顯

目前NGS 技術不僅可以一次性獲得大量腫瘤組織內部變異信息，還具備了足夠的靈敏性進行ctDNA 的基因變異檢測，為我們從基因水平深入了解腫瘤復發提供了堅實的技術基礎［28］。

3.1 NGS 檢測技術可靠，準確性高

在國內外研究中，Tuononen 等［29］和支修益等［30］團隊先后對腫瘤組織樣本進行了NGS 和qPCR 技術檢測比較，結果發現兩者檢測靈敏度和準確率相似，且NGS 技術提供的基因突變信息更加豐富、精確。目前，越來越多的實體瘤NGS 伴隨診斷產品獲批，以Guardant 360 CDx 為例，其在組織和液體活檢結果一致性98.2% 以上，ctDNA 陽性預測值100%［31］。

3.2 NGS 檢測范圍廣泛，一網打盡

NGS 技術的檢測通量和單堿基成本均優于Sanger 測序，甚至能夠檢測ROS1 重排、MET 擴增、NTRK 融合、NGR1 融合等PCR 法無法檢測的罕見突變［28］。對于ALK 等適用于免疫組化或熒光原位雜交檢測的特定基因，NGS 檢測則可避免多基因不同檢測方法的重復，節省檢測成本和時間［32］。隨著檢測技術的進步，更大panel 的伴隨基因診斷產品逐漸從研究走向市場，實現NSCLC 驅動基因與伴隨基因一網打盡的目的。

3.3 NGS 監測腫瘤耐藥，精準預測

NGS 檢測助力臨床用藥，能實時監測腫瘤療效，早期發現NSCLC 耐藥突變靶點，并協助研究者對 耐 藥 機 制 進 行 深 入 探 索［33，34］。NGS 檢 測 指 導 臨床決策者及時調整患者的個性化治療方案，并為NSCLC 患者帶來確實可靠的生存獲益。而且，NGS 或取更廣泛的基因圖譜，是成藥靶點與新藥研發的重要途經［32］。

4 伴隨基因診斷及臨床意義

近年來，肺癌少見基因變異被逐漸鑒定，靶向藥物獲得性耐藥機制也隨之更加完善，臨床對基因檢測提出了更高需求。ctDNA 檢測允許患者可實時取樣評估病情，對于監測NSCLC 伴隨基因動態變化具有明顯優勢。如此，患者可及時掌握腫瘤狀態和病情變化，提高療效評價準確度，從而更好地及時調整治療方案［19］。國內外各大指南均建議使用更大panel 的基因檢測產品以獲取更多基因圖譜信息，識別罕見變異或耐藥相關伴隨基因，確定可用于臨床治療靶點［32］。

從基因層面來說，EGFR 突變合并其他伴隨基因突變，容易導致下游或旁路信號通路激活［35］。檢測出的伴隨基因突變越多，越容易出現EGFR-TKI耐藥［35-37］。

肺癌伴隨基因譜系主要包括TP53、KRAS、ERBB2、MET、NRAS、BRAF 等，肺鱗癌中伴隨基因 多 見 中FGFR1 擴 增、PIK3CA 和BRAF 等，其 突變頻率或可高達50%以上［38］。抑癌基因TP53 突變后損害基因監視功能，導致腫瘤的發生［39］。伴隨TP53 基因突變的患者無進展生存期（progression free survival， PFS）和OS 明顯縮短，提示TP53 伴隨突變患者預后不良［39］。例如，BENEFIT 研究發現僅存在EGFR 敏感突變患者，PFS 可達13.2 個月，合并TP53 突變組PFS 減少為9.3 個月［37］。Blakely等［40］將1 122 例 晚 期EGFR 突 變 型 與944 例EGFR野生型肺癌患者ctDNA 檢測結果對比，鑒定出PIK3A、BRAF、MET、MYC、CDK6 和CTNNB1 等具有功能意義的伴隨基因，而CTNNB1 或PIK3CA等伴隨突變通過協同作用以利于腫瘤耐藥和轉移的發生。

總之，伴隨突變對NSCLC 的預后差異有較大影響，臨床上應根據不同分子分型結果，并結合患者實際情況制定個體化治療方案，從而更有利于控制疾病進程，提高患者生存獲益［41，42］。

5 總結

對NSCLC 患者進行ctDNA 動態監測，不僅能夠幫助研究經典驅動基因突變對靶向治療療效獲益的影響，還能夠識別非經典伴隨基因突變的致病差異以及對臨床預后的影響。臨床對外周血液體活檢標準制定和質量控制尚未統一，仍然需要改進基因檢測技術，以提高其精確性、及時性和臨床實用性。而且，仍有太多的伴隨基因機制尚不清楚，未來對于伴隨基因在臨床用藥和療效監測中的實際意義、基因檢測技術的優化提升等方面仍需深入研究，以期擴大靶向治療的受益人群范圍，改善患者預后與生活質量。

作者貢獻度說明：

薛崇祥：文獻的整理和文章撰寫；張旭：文獻資料檢索與整理；魯星妤：為本文寫作思路提供了指導，參與了文獻的搜索和文章修改；崔慧娟：負責論文設計、修改并審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。