新型酸響應聚集型金納米粒子制備與光熱性能

汪 翔, 孫天賜, 肖正昊, 王慧慶

(合肥工業大學 化學與化工學院,安徽 合肥 230009)

0 引 言

近紅外光熱治療腫瘤是將有光熱轉換功能的納米材料注射聚集于腫瘤組織,在外部近紅外光源的照射下材料將光能轉化為熱能來殺死癌細胞的治療方法[1]。近紅外光擁有穿透組織深度深、衰減弱和對組織損傷小等優點[2]。此外,近紅外光還能實現對腫瘤區域照射,達到最大限度地減少副作用的效果[3]。金、銀、鉑、鈀等貴金屬材料是目前近紅外治療研究最多的材料之一。其中金納米粒子(gold nanoparticles,Au NPs)因其生物條件下穩定性好,使其成為研究最多的光熱傳導材料[4],也是有前途的腫瘤光熱治療劑[5]。其光熱治療效果與尺寸有關,只有尺寸大于50 nm的金納米粒子才有強烈的近紅外吸收。但與大顆粒相比,小尺寸金納米粒子在血液中停留時間更長,更容易進入腫瘤組織。為了解決上述矛盾,目前已開發許多將金納米粒子組裝成新型功能材料技術[6],例如通過腫瘤局部微環境刺激響應(氧化還原響應[7]、pH響應[8]或特異性酶[9])誘導該粒子聚集引起越來越多的研發興趣。

與正常組織相比較,腫瘤部位呈酸性微環境。本文合成了pH響應性原酸酯親水鏈,并將其修飾到金納米粒子表面,制備新型酸性響應聚集型金納米粒子材料。在中性環境下金納米粒子穩定分散,而在酸性環境下,原酸酯鍵斷裂、親水鏈解離、疏水基團暴露,引起金納米粒子的聚集,并呈更大尺寸團簇,以提升金納米對近紅外的吸收能力。對比研究了這種酸敏感修飾和傳統無響應性修飾的金納米粒子的光熱效率。本文方法可以拓展到其他腫瘤光熱治療納米材料上,為提高腫瘤光熱治療效果提供新策略。

1 實驗部分

1.1 實驗原料

原甲酸三甲酯、3-氨基-1,2-丙二醇、三氟乙酸乙酯、對甲苯磺酸一水合物、聚乙二醇單甲醚、氯金酸、溴代異丁酰溴均購自阿拉丁生化科技股份有限公司;碳酸氫鈉、氯化鈉、硼氫化鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司。

化學結構采用安捷倫VNMR S600型核磁共振氫譜儀(proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)進行測試;樣品形貌結構采用日本JEM-2100F型場發射透射電子顯微鏡(field emlssion transmission electron microscope,FETEM)分析。

1.2 實驗過程

1.2.1 pH敏感原酸酯親水鏈的合成

pH敏感原酸酯親水鏈的合成是根據文獻[10]的方法稍加改動, 具體過程如圖1所示。

圖1 原酸酯親水鏈的合成過程示意圖

在氮氣保護下,向120 mL 3-氨基-1,2-丙二醇(18.80 g, 0.21 mol)的DCM溶液中滴加三氟乙酸乙酯(34.30 g, 0.24 mol),反應4 h,蒸發溶劑,殘液溶解于200 mL乙酸乙酯中用飽和KHSO4和NaCl洗滌,經MgSO4干燥獲得產物P1。

將P1 (13.50 g,72.15 mmol)與原甲酸三甲酯(34.89 g,0.33 mol)溶解于110 mL DCM后,加入微量對甲苯磺酸(p-TSA),室溫下反應6 h,除去溶劑后溶于250 mL乙酸乙酯中,用飽和碳酸氫鈉和鹽水依次洗滌,用MgSO4干燥獲得產物P2。

將上述P2(3 g,13 mmol)溶于30 ml甲苯,加入PEG-OH (16.3 g, 3.2 mmoL),p-TSA (0.025 g, 0.13 mmol),吡啶(0.13 mL, 1.5 mmol), 110 ℃回流過夜,冷卻到室溫后與過量冷乙醚混合,過濾,真空干燥獲得產物P3。

將P3(6.0 g, 1.0 mmol)溶解于30 mL THF,在0 ℃下逐滴加入30 mL 4% NaOH水溶液,常溫下反應過夜,蒸發除去THF后用DCM萃取,用K2CO3干燥后過濾、濃縮,得到產物P4。

將P4 (3 g,0.6 mmol)和三乙胺(200 mg,2 mmol)在溶于25 mL DCM中,0 ℃條件下逐滴加入溴乙酰溴(0.37 g,1.8 mmol)后反應4 h,反應產物過濾后用CHCl3萃取剩余有機溶液,并用無水K2CO3干燥后濃縮得到P5。

將P5(2.3 g,0.1 mmol)和硫代乙酸鉀(45.7 mg,0.4 mmol)溶于20 mL DMF,反應24 h后過濾、濃縮、干燥得到P6。

將P6(2.3 g,0.1 mmol)溶于6 mL DMF為溶劑, 在避光條件下加入3 mL哌啶進行切斷反應,反應24 h后,過濾、濃縮、干燥得到末端為巰基的原酸酯親水鏈P7(POE-SH)。

1.2.2 POE-Au NPs和PEG-Au NPs的制備

用去離子水將2.5 mL HAuCl4溶液(2.2 mg/mL) 稀釋至50 mL,在強力磁攪拌下加熱至沸騰。隨后將2 mL 1%檸檬酸鈉溶液快速加入混合物中,繼續煮沸直到溶液變為酒紅色獲得 Au NPs。將1 mL Au NPs與5 mL PEG-SH (1 mg/mL)或POE-SH (1 mg/mL)在 37 ℃以150 r/min攪拌速度下孵育8 h以上,獲得PEG-Au NPs或POE-Au NPs。合成過程如圖2所示。

圖2 POE-Au NPs的合成

1.2.3 光熱性能測試

取上述 1 mL POE-Au NPs和PEG-Au NPs溶液置于石英皿粒度池中,并將溶液pH值調整為5.5左右,靜置1 h后,用近紅外 808 nm 激光器,并以2 W/cm2的功率分別照射,用紅外熱成像儀器實時監測溶液的溫度,每隔 30 s 記錄1次相應溫度。

1.2.4 細胞安全性測試

新型金納米材料的生物安全性采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法[11]評估。將人臍靜脈內皮細胞 (HUVECs)以5×104個/孔接種于含有細胞培養基的96孔板中,孵化24 h后,加入不同濃度的PEG-Au NPs和 POE-Au NPs后共培養24 h。用PBS洗滌3次后在每個孔板中加入50 μL MTT(1 mg/mL),繼續培養4 h。去除上清液后加入100 μLDMSO搖勻,用Elx800分光光度酶標儀(BioTek,USA)測定570 nm處的吸光值,計算相對細胞活性。

2 結果與討論

2.1 pH敏感原酸酯親水鏈的1H NMR譜圖

本文設計合成的新型pH敏感原酸酯親水鏈合成過程中系列產物的1H NMR譜圖如圖3所示。

圖3 新型原酸酯親水鏈合成系列產物的1HNMR譜圖

P1的1H NMR譜圖如圖3a所示,由圖3a可知:δ=9.24×10-6為仲胺的質子峰;δ=4.87×10-6、4.62×10-6為2個羥基質子峰;δ=3.62×10-6為次甲基吸收峰;δ在3.04×10-6～3.34×10-6間為2個亞甲基吸收峰。

P2的1H NMR譜圖如圖3b所示,由圖3b可知:δ在5.60×10-6～5.64×10-6間為五元環上原酸酯特征吸收峰;δ在4.29×10-6～4.36×10-6間為五元環上次甲基吸收峰;δ在3.59×10-6～4.04×10-6間為五元環外亞甲基吸收峰;δ在3.36×10-6～3.54×10-6間為五元環上亞甲基吸收峰;δ在3.16×10-6～3.24×10-6間為甲基吸收峰。

P3的1H NMR譜圖如圖3c所示,由圖3c可知:δ=8.16×10-6為仲胺質子峰,δ在5.84×10-6～5.92×10-6間為五元環上原酸酯特征峰,表明五元環未被破壞;δ在3.52×10-6～3.78×10-6間為五元環外OCH2CH2O—質子峰,表明成功接上PEG鏈段。

P4的1H NMR譜圖如圖3d所示,由圖3d可知:δ在5.84×10-6～5.87×10-6間為五元環上原酸酯特征峰;δ在3.49×10-6～3.69×10-6間為五元環外OCH2CH2O—的質子峰。

P5的1HNMR譜圖如圖3e所示,由圖3e可知,δ=4.15×10-6為溴乙酰溴亞甲基峰,δ在5.89×10-6～5.97×10-6間為原酸酯特征峰。P6的1H NMR譜圖如圖3f所示,由圖3f可知,δ=5.82×10-6原酸酯的特征峰仍然存在,δ=2.3×10-6為羰基處的甲基峰。P7的1HNMR譜圖如圖3g所示,由圖3g可知,δ=5.82×10-6原酸酯特征峰保留,δ=2.3×10-6處的甲基峰消失,證明目標原酸酯親水鏈的成功制備。

2.2 金納米的形貌與pH響應性

用TEM觀察PEG-Au NPs和 POE-Au NPs 2種金納米粒子在不同pH值下的形貌和尺寸,如圖4所示。

圖4 不同pH值條件下PEG-Au和 POE-Au 的TEM照片

由圖4可知, pH=7.4時PEG-Au NPs和POE-Au NPs金納米粒子呈單分散的球形,尺寸在5 nm左右;而置于模擬腫瘤酸性(pH=5.5)微環境下1 h后,觀察到PEG-Au NPs形態未發生改變(圖4c),POE-Au NPs聚集成幾百納米的團簇,其原理如圖5所示。在酸性條件下,金納米表面修飾鏈從原酸酯鍵處斷裂、親水鏈段被切斷,使得疏水性基團暴露出來,金納米體從而聚集成更大尺寸的金納米團簇。

圖5 POE-Au NPs酸響應聚集示意圖

2.3 酸性下金納米粒子的光熱效應

將PEG-Au NPs和 POE-Au NPs 2種金納米水溶液(200 μg/mL)調節pH=5.5,1 h后用808 nm激光照射(輻照劑量2 W/cm2),并記錄照射時間與光熱轉化后的溶液升溫和降溫結果,如圖6所示。從圖6可以看出,在相同質量濃度、相同激光功率下,隨著照射時間延長PEG-Au NPs和 POE-Au NPs均發生升溫現象,在照射15 min后PEG-Au NPs水溶液溫度升到峰值50.5 ℃,而POE-Au NPs水溶液溫度能達58.7 ℃,根據公式[11]計算出光熱轉換效率從47.6% 提高到了58.8%。從而證實經原酸酯親水鏈修飾后的金納米粒子因酸響應性聚集對近紅外區的吸收能力更強,表現出更加優異的光熱性能。

圖6 POE-Au NPs與PEG-Au NPs水溶液的升降溫曲線

2.4 生物安全性分析

本文進一步用MTT法評估了新型酸響應性金納米材料的細胞安全性。將不同質量濃度(0、50、100、150、200 μg/mL)的PEG-Au NPs和 POE-Au NPs 2種金納米粒子與HUVECs細胞共培養時的細胞活性如圖7所示。

圖7 PEG-Au NPs和 POE-Au NPs的細胞毒性

由圖7可知,當金納米粒子的質量濃度高達200 μg/mL時,PEG-Au NPs和 POE-Au NPs 2種金納米粒子的相對細胞活性仍然高于92%,表明2種金納米粒子均具有很高的細胞安全性。

3 結 論

本文合成了一種表面修飾了含酸敏感原酸酯基親水鏈的金納米粒子POE-Au NPs。TEM顯示,POE-Au NPs在pH=5.5條件下會因表面原酸酯鍵斷裂、親水鏈的解離、疏水基團暴露而從5 nm單分散體聚集成幾百納米的團簇。光熱效果測試表明,酸響應聚集后的POE-Au NPs顯示出比單分散性PEG-Au NPs更高的光熱轉換效率,此外細胞安全性評估結果證實POE-Au NPs具有良好的生物安全性。這種新型酸響應聚集性金納米粒子的設計制備為開發高效抗腫瘤光熱治療材料提供了新策略。