羅漢果甜苷提純工藝優(yōu)化研究

＊張延飛 馮茂財 賈如輝 賀志壯 趙吉合

（1.中國科學院青島生物能源與過程研究所 山東 266101 2.青島農(nóng)業(yè)大學 山東 266101 3.山東省青島第六十七中學 山東 266101 4.青島浩然海洋科技有限公司 山東 266101）

引言

羅漢果甜苷無毒性[1-3]，具有降低血糖[4]、治療肺部炎癥[5-7]、抗氧化[8]、抗菌[9]、保護肝臟[10]等多種生理活性和功效。因此其分離純化引起了研究者的廣泛關(guān)注。

目前所報道的提取方法主要有水提取法、超聲提取法、微波提取法和閃式提取法等[11]。水提取法主要使用水、乙醇或者兩者的混合作為溶劑進行提取。如閆家瑋等[12-13]將羅漢果水煮后，用不同的膜或大孔吸附樹脂對羅漢果浸出液進行分離濃縮，獲得了較高的產(chǎn)品收率。朱曉韻等[14]采用微波技術(shù)進行了羅漢果甜苷的提取，結(jié)果表明，微波提取法的效率明顯優(yōu)于常規(guī)水煮法。劉振洋等[15-16]利用閃式提取法進行羅漢果甜苷的提取，利用正交試驗法進行了工藝優(yōu)化，得到羅漢果甜苷的純度達到92%以上。但在羅漢果甜苷提取研究中，存在較多干擾成分，如脂肪、蛋白、黃酮等含量較多，嚴重影響了甜苷質(zhì)量。

本研究主要針對羅漢果甜苷提取中的脂肪、蛋白等干擾組分，選擇成本較低的水提技術(shù)作為對比，采用有機溶劑索氏提取脂肪和堿沉蛋白的方法，丙酮做為索氏提取劑，Ca(OH)2作為澄清劑和蛋白質(zhì)變性劑，使用大孔樹脂作為提純物質(zhì)，優(yōu)化了溶劑、料液比和樹脂等條件，得到羅漢果甜苷在此條件下的最佳產(chǎn)率為81.1%。

1.試驗部分

(1)試驗試劑

Ca(OH)2（95%）、濃硫酸（95%～98%）、石油醚（90%）、丙酮（99.5%）、活性炭、732強酸苯乙烯陽離子交換樹脂、NaCl（99%）、香蘭素（99%），國家集團化學試劑有限公司；無水乙醇（99.7%），天津市富宇精細化工有限公司；YKD151大孔丙烯酸陽離子交換樹脂，天津允開樹脂科技有限公司；硅膠（粒度200～300），青島海洋化工；牛血清蛋白（99%），Biosharp公司。

(2)試驗儀器

紫外/可見分光光度計（5100型），上海元析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4），友誠新能源有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300DE型），昆山市超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機（Neofuge 15R），力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；電熱鼓風干燥箱（DHG-9203A），上海精宏實驗設備有限公司；高效液相色譜儀（U3000），美國賽默飛世爾科技。

(3)甜苷分離

選取300mL玻璃柱，分別裝入柱高1/3的大孔丙烯弱酸陽離子樹脂和強酸苯乙烯陽離子樹脂，上層用0.5cm厚的硅膠封柱。將試管中的提取液2.5mL加入色譜柱中，用60%的乙醇溶液洗脫。用錐形瓶接收洗脫液，觀察柱子的下口滴出有顏色的瞬間，更換干凈的錐形瓶，持續(xù)滴加乙醇溶液，直到下口滴出顏色變?yōu)闊o色，等乙醇溶液下降至硅膠表面時，更換新的錐形瓶同時純水繼續(xù)洗脫，等顏色變?yōu)闊o色。將洗脫液放于蒸發(fā)皿中待溶液蒸發(fā)，得甜苷樣品粉末。

(4)甜苷和蛋白檢測

甜苷檢測：準確稱取0.200g甜苷對照品，溶解定容100mL，得2mg/mL溶液。使用移液槍移取2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5.0mL羅漢果甜苷的對照溶液于50mL容量瓶中定容，得0.08mg/mL、0.10mg/mL、0.12mg/mL、0.14mg/mL、0.16mg/mL、0.18mg/mL、0.20mg/mL溶液。再分別稀釋100倍后裝入離心管待用。把50mL的濃硫酸緩慢加入10mL水中，等待冷卻至室溫，加入1.0g香蘭素并攪拌，使其完全溶解。加入5mL顯色劑到離心管中沸水中加熱1h。比色皿中加入標準溶液，制作標準曲線。如圖1所示，線性回歸方程a＝3.9125x＋0.20679，R2＝0.9975。然后依次加入樣品溶液，并記錄數(shù)據(jù)，計算樣品含量。

圖1 甜苷的標準曲線和蛋白的標準曲線

蛋白檢測：按照50體積BCA試劑加1體積Cu試劑配制成BCA工作液，充分混勻。用蒸餾水稀釋100μL到1mL，得到濃度為0.5mg/mL的牛血清蛋白標準液。分別配置0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的牛血清蛋白標準溶液200μL，將配制好的待測蛋白溶液與2mL的BCA工作液混合后立即搖勻，在37℃下放置15～30min，將反應完全的試劑倒入比色皿中，用紫外可見分光光度計測562nm處的吸光度制作標準曲線，標準曲線的方程y=2.7751x+0.0364，R2=0.9948。將第一次水煮只經(jīng)過Ca(OH)2處理和最終所得到的樣品液兩份樣品200μL加入2mL工作液，在37℃下反應15～30min，待反應完全，用分光光度計測定562nm處的吸光度，根據(jù)標準曲線計算蛋白質(zhì)含量。

2.結(jié)果與討論

(1)溶劑對去除脂肪的影響

本實驗采用石油醚和丙酮分別進行索氏提取，脂肪去除率的計算公式為：X=（m1-m0）/m2×100%（X指的是在提取條件下，每百克的脂肪的總含量，以g/100g的形式計算；m1是在這種條件下，樣品與濾紙包的總質(zhì)量，以g計算；m0是在這種條件下，去掉濾紙包之后，樣品的總質(zhì)量，以g計算；m2則是在沒有進行任何改變之前，樣品與濾紙包的總質(zhì)量，以g計算。）計算所得石油醚和丙酮提取脂肪率分別為：

由上式可知，丙酮在提取羅漢果的脂肪方面要強于石油醚。

(2)溶劑對糖苷提取的影響

在索氏提取中使用了石油醚和丙酮兩種極性不同的物質(zhì)和不使用索氏提取三種方法作為對照。由圖2可知使用丙酮提取效率最好，使用水煮的方法次之，效果最差的是使用石油醚提取。但是當料液比低于1:10時石油醚效果強于水煮，三者都是在料液比為1:15時提取量最高，使用丙酮的料液比為1:15和1:20的提取效果相差不大。

圖2 不同溶劑提取的糖苷的吸光度

圖3 不同料液比下強弱離子樹脂對糖苷提取的影響

(3)提取次數(shù)的影響

對羅漢果粉末進行三次水煮提取，采用強酸苯乙烯陽離子樹脂分離提取液，測得不同料液比下的吸光度如圖4所示。結(jié)果表明，第一次水煮所得出的含量數(shù)值很高，且當料液比為1:15時遠高于其1:5、1:10和1:20這三種情況的吸光度，當水煮次數(shù)超過三次之后，其吸光度基本消失，在1:20時提取不完整，在水煮第四次仍有部分吸光度。因此三次提取效果較佳。

圖4 水煮次數(shù)對糖苷提取的影響

3.結(jié)論

本實驗針對羅漢果甜苷提取中脂肪、蛋白等干擾組分，探索了索氏溶劑提取的條件。得出最優(yōu)方法是使用丙酮做提取劑，料液比為1:15，水煮溫度為65℃，水煮3次，加入Ca(OH)2作為澄清劑和蛋白質(zhì)變性劑，使用強酸性離子交換樹脂作為提純物質(zhì)，得出產(chǎn)率最佳為81.1%。