滲透壓對(duì)林可霉素發(fā)酵效價(jià)影響的研究

＊陳東 郭佳 馬思麗

（寧夏泰益欣生物科技股份有限公司 寧夏 750205）

林可霉素（Lincomycin）是一種林可胺類(lèi)抗生素，是由林可鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。1962年，Mason等人從美國(guó)林肯市的土壤中發(fā)現(xiàn)了一種放線菌，并從該菌中分離得到了林可霉素。由于林可霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性球菌及厭氧菌具有良好的抗性，因此在臨床治療中被廣泛應(yīng)用[1]。

林可霉素是由甲硫林可胺與丙基脯氨酸通過(guò)肽鍵鏈接而成的，包括林可霉素A、林可霉素B、林可霉素C、林可霉素D、林可霉素S和林可霉素K等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1和表1所示。通常所說(shuō)的林可霉素是指林可霉素A，其分子式為C18H34N2O6S，分子量為406.56。林可霉素A具有良好的抗菌效果且毒性較低，而林可霉素B因有較大毒性且抗菌活性低，因此常被用作評(píng)價(jià)林可霉素原料藥質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)[2]。

表1 林可霉素組分結(jié)構(gòu)一覽表

表2 實(shí)驗(yàn)儀器

圖1 林可霉素結(jié)構(gòu)圖

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于提高林可霉素A產(chǎn)量及降低林可霉素B含量的相關(guān)報(bào)道中，主要研究集中于培養(yǎng)基優(yōu)化，包括在發(fā)酵過(guò)程中直接添加前體、氨基酸、甲基化試劑等[3]，但通過(guò)添加鹽調(diào)節(jié)滲透壓是否會(huì)提高林可霉素A產(chǎn)量及降低林可霉素B含量的報(bào)道相對(duì)較少。本研究通過(guò)添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%）調(diào)節(jié)發(fā)酵液滲透壓，測(cè)定林可霉素A和林可霉素B效價(jià)，探究滲透壓對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響，并在最適滲透壓條件下比較了甘油、脯氨酸和甜菜堿三種滲透壓保護(hù)劑對(duì)林可霉素效價(jià)的影響，以期確定提高林可霉素A效價(jià)及降低林可霉素B效價(jià)的最適滲透壓范圍和最適滲透壓保護(hù)劑及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為林可霉素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1.儀器與試劑

(1)試劑

葡萄糖、玉米漿、有機(jī)硅消泡劑、聚醚類(lèi)消泡劑，均為工業(yè)級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、硫酸銨、氯化鈉，均為分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈣，分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司；甘油，分析純，上海泰坦科技股份有限公司；甜菜堿、脯氨酸，均為分析純，Sigma；黃豆餅粉，工業(yè)級(jí)，實(shí)驗(yàn)室自備。

(2)儀器設(shè)備

2.材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料

林可鏈霉菌菌種由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定林可霉素A與林可霉素B效價(jià)。

3.結(jié)果與分析

(1)滲透壓對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響

在生物發(fā)酵過(guò)程中，菌體會(huì)受到各種因素的刺激，如氧化還原、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)饑餓、高溫、低溫等，這些因素會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)、生產(chǎn)以及代謝過(guò)程[4]。已有研究顯示，一些與滲透響應(yīng)有關(guān)的產(chǎn)物，若將培養(yǎng)基的滲透壓調(diào)至合適區(qū)間，則有助于目的產(chǎn)物的積累。目前相關(guān)研究主要是通過(guò)向發(fā)酵液中添加一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl、KCl和葡萄糖調(diào)控滲透壓。本研究是以NaCl為滲透壓調(diào)節(jié)劑，探究滲透壓對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響。

NaCl初始添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%，并進(jìn)行10天的發(fā)酵，結(jié)果如表3所示，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，發(fā)酵液滲透壓也逐漸增大，這說(shuō)明滲透壓與鈉離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～1.0%時(shí)，隨著滲透壓的增大，林可霉素A的效價(jià)逐漸上升，林可霉素B的效價(jià)逐漸下降，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%～2.5%時(shí)，隨著滲透壓的增大，林可霉素A的效價(jià)逐漸下降，林可霉素B的效價(jià)逐漸上升。因此，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)（滲透壓1.082 Osmol/kg）效果最好，林可霉素A效價(jià)達(dá)到最大值11426μg/mL，較對(duì)照組10461μg/mL提高了9.22%，林可霉素B的效價(jià)達(dá)到最小值16μg/mL，較對(duì)照組26μg/mL降低了38.46%，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以1.0% NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)劑的最適添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響

(2)滲透壓保護(hù)劑的選擇

滲透壓保護(hù)劑是一種相容性溶劑，能有效保護(hù)微生物在極端滲透壓環(huán)境中膜的完整性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，保證微生物在極端滲透壓環(huán)境中也能存活[5]。在高滲環(huán)境中，微生物可以通過(guò)滲透壓應(yīng)激響應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)合成滲透壓保護(hù)劑，也可以從環(huán)境中攝取部分滲透壓保護(hù)劑，使微生物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓達(dá)到平衡[6]。為了降低林可鏈霉菌在高滲環(huán)境中的不適，本研究分別向發(fā)酵液中添加了甘油、脯氨酸和甜菜堿這三種常見(jiàn)的滲透壓保護(hù)劑，并分析比較了這三種滲透壓保護(hù)劑對(duì)林可霉素A和林可霉素B效價(jià)的影響。

甘油對(duì)林可霉素效價(jià)影響的結(jié)果如圖2所示，林可霉素A的效價(jià)隨甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，在甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，林可霉素A的效價(jià)最高為11978μg/mL，較CK組（10461μg/mL）提高了14.50%，較1.0% NaCl組（11426μg/mL）提高了4.83%，林可霉素B的效價(jià)隨甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈先下降后上升的趨勢(shì)，在甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，林可霉素B的效價(jià)最低為12μg/mL，較CK組（26μg/mL）降低了53.85%，較1.0% NaCl組（16μg/mL）降低了25.00%。上述結(jié)果表明0.5%甘油對(duì)提高林可霉素A產(chǎn)量和降低林可霉素B含量效果最優(yōu)。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘油作為滲透壓保護(hù)劑對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響

脯氨酸是一種非常重要的胞內(nèi)可溶性物質(zhì)，除了在胞內(nèi)自身合成外，還可以從外界環(huán)境中獲取，其生理功能主要包括增加細(xì)胞蛋白質(zhì)和膜的穩(wěn)定性，作為共同氮源或碳源進(jìn)入細(xì)胞代謝以及作為抵御外界高滲環(huán)境[7]，因此選用脯氨酸作為林可霉素發(fā)酵過(guò)程中的滲透壓保護(hù)劑，研究其對(duì)林可霉素A和林可霉素B效價(jià)的影響，結(jié)果如圖3所示，林可霉素A的效價(jià)隨脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%時(shí)，林可霉素A的效價(jià)最大為12123μg/mL，較CK組（10461μg/mL）提高了15.89%，較1.0% NaCl組（11426μg/mL）提高了6.10%，林可霉素B效價(jià)隨脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈先下降后上升的趨勢(shì)，在脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%時(shí)，林可霉素B的效價(jià)最小為11μg/mL，較CK組（26μg/mL）下降了57.69%，較1.0% NaCl組（16μg/mL）降低了36.36%，上述結(jié)果表明0.25%脯氨酸對(duì)提高林可霉素A產(chǎn)量降低林可霉素B含量效果最優(yōu)。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的脯氨酸作為滲透壓保護(hù)劑對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響

甜菜堿是一種氨基酸甲基取代物，存在于幾乎所有微生物體內(nèi)且滲透效能很好，因此是常用的一種滲透壓保護(hù)劑[8]。結(jié)果如圖4所示，隨著甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高林可霉素A的效價(jià)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%時(shí)，林可霉素A的效價(jià)最高為11997μg/mL，較CK組（10461μg/mL）提高了14.68%，較1.0% NaCl組（11426μg/mL）提高了5.00%，林可霉素B的效價(jià)隨甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先下降后上升的趨勢(shì)，在甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%時(shí)，林可霉素B效價(jià)最低為12μg/mL，較CK組（26μg/mL）降低了53.85%，較1.0% NaCl組（16μg/mL）降低了25.00%，上述結(jié)果表明0.25%甜菜堿對(duì)提高林可霉素A產(chǎn)量降低林可霉素B含量效果最優(yōu)。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甜菜堿作為滲透壓保護(hù)劑對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響

4.結(jié)論

本文以NaCl為滲透壓調(diào)節(jié)劑研究滲透壓對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響，并在最適滲透壓條件下分析了甘油、脯氨酸和甜菜堿三種滲透壓保護(hù)劑對(duì)林可霉素效價(jià)的影響。結(jié)果表明，隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，滲透壓逐漸增大，表明滲透壓與鈉離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比；林可霉素A的效價(jià)隨滲透壓的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，林可霉素B的效價(jià)隨滲透壓的增大呈先下降后上升的趨勢(shì)，且在滲透壓為1.082 Osmol/kg（1.0% NaCl）時(shí)，林可霉素A效價(jià)最高，林可霉素B效價(jià)最低。因此，以1.0% NaCl作為滲透壓保護(hù)劑的篩選條件，篩選最適滲透壓保護(hù)劑及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)在甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)林可霉素A效價(jià)顯著高于對(duì)照組，林可霉素B效價(jià)顯著低于對(duì)照組，脯氨酸和甜菜堿都是在0.25%時(shí)林可霉素A效價(jià)顯著高于對(duì)照組，林可霉素B效價(jià)顯著低于對(duì)照組。因此在適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)下三種滲透壓保護(hù)劑都可以有效提高林可霉素A產(chǎn)量降低林可霉素B含量，且比較發(fā)現(xiàn)0.25%脯氨酸＞0.25%甜菜堿＞0.5%甘油。綜上所述，在1.0% NaCl+0.25%脯氨酸時(shí)可以有效提高林可霉素A產(chǎn)量降低林可霉素B含量。