泛素特異性蛋白酶7功能和在結直腸癌中的研究進展

付錦程 付濤

泛素特異性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease 7,USP7)是一種廣泛參與DNA修復、細胞分裂、細胞凋亡、基因表達、蛋白定位、蛋白降解等多種細胞過程的去泛素化酶[1]。有研究表明,UPS7在調節多種信號通路相關因子、調控細胞增殖和凋亡、協助建立腫瘤免疫逃逸、參與DNA損傷修復等促進腫瘤發生,發展的機制中發揮著重要的作用。USP7廣泛的生物學效應使其成為研究腫瘤機制和進展過程的重要分子。本文對USP7的結構、廣泛的生物學功能及其在結直腸癌中的研究進展進行綜述。

一、USP7的結構與功能

USP7能與單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1) 編碼的具有泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzymes 3,E3)活性的感染性細胞蛋白(infected cell protein 0,ICP0)結合,也被稱為皰疹病毒相關泛素特異性蛋白(herpesvirus-associated ubiquitin-specific protein,HAUSP)[2]。USP7由1 102個氨基酸組成,具有高度保守的結構域,自氨基末端至羧基末端包括：氨基末端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,poly Q)延伸,腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-related factor,TRAF)樣結構域,催化結構域(catalytic domain,CD)和羧基末端區域。

USP7是一種半胱氨酸蛋白酶,具有三個部分的保守USP7結構域,稱為手指、拇指和手掌[3-4]。USP7結構域的大小從300到800多個氨基酸不等[3]。輔助結構域,包括泛素相關結構域(UBA)、泛素相互作用基序(UIM)和鋅指泛素特異性蛋白酶結構域(ZnF-UBP)以及末端擴展,被認為賦予了USP7的底物特異性[3,5]。由于一些USP7控制細胞周期進程、DNA損傷修復和與癌癥相關的細胞信號,它們在腫瘤發生中的作用已被研究[3,6-8],關于其結構和功能也是最近才開始被研究[9]。

二、USP7的功能

1.p53依賴途徑：隨著研究的深入,越來越多的USP7底物被鑒定出來,這些底物中關于p53的研究最為透徹。正常細胞中的p53主要通過Murine double minute 2(MDM2)介導的泛素化和隨之而來的降解維持低水平狀態[10]。p53和MDM2均是USP7的底物,且以互斥的方式特異性地識別USP7 的TRAF樣結構域,由于MDM2的親和力強于p53,因此,正常細胞穩態中MDM2是USP7的首選底物[11-12]。在細胞應激的條件下,MDM2磷酸化降低了其與USP7結合的親和力,使USP7從穩定MDM2轉換為穩定p53,誘導凋亡途徑激活[13],這個現象被研究人員稱為“開關”效應。腫瘤抑制因子p53在腫瘤預防中起著重要作用。在人類腫瘤的發展過程中,p53經常因直接突變或調節蛋白的表達改變而失活。p53是分子網絡中的一個中心樞紐,它能感知各種細胞應激,并引發有效的抗增殖反應,包括細胞周期阻滯、凋亡和衰老。此外,p53還參與調控其他細胞過程,如代謝、自噬和鐵死亡等[14]。

2.非p53依賴途徑：除了USP7-MDM2-p53軸之外,USP7還通過p53非依賴性的途徑參與細胞增殖和凋亡調控,這種效應主要源于USP7參與調節多種信號通路相關因子,改變它們的表達水平和亞細胞定位。

USP7可以通過逆轉多泛素化,穩定轉錄因子導致其靶點表達增加,如USP7通過TRAF樣結構域和Ubl結構域與NOTCH1胞內結構域(Intracellular domain of NOTCH1,ICN1)交互,使其穩定并異常激活,導致NOTCH1靶基因的表達上調,促進急性T淋巴細胞白血病的發展,而USP7缺失可使NOTCH1的多聚泛素化增強,導致其降解[15]。

USP7可以使E3泛素連接酶NEDD4L去泛素化,通過NEDD4L-SMAD軸影響神經系統[16]。USP7也可以調節TBX3、直接結合TBX3并減少其泛素化和降解來抑制p57KIP2的表達,促進甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖[17]。USP7逆轉單泛素化和多泛素化標記的能力使其能夠從多方面調節信號通路轉錄因子,這種通過逆轉多泛素化改變轉錄因子的穩定性和逆轉單泛素化改變轉錄因子的亞細胞定位之間的差異性,將是一個有待進一步研究的課題。

3.促進DNA修復及細胞分裂分化：USP7對DNA損傷和耐受有重要作用。當細胞出現DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks ,DSBs)時,會出現DNA損傷反應(DNA damage response,DDR),這個過程需要關鍵調控因子MRE11-RAD50-NBS1(MRN)復合物和DDR信號的核心成分DNA損傷檢查點蛋白調節因子1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1,MDC1)。MRN識別DSBs信號時導致MDC1與磷酸化組蛋白H2AX結合,使得泛素E3連接酶RNF168聚集,促進多聚泛素鏈在染色質上形成,同時生成染色質綁定的p53結合蛋白1(p53 binding protein 1,p53BP1)和乳腺癌蛋白1(breast cancer protein 1),產生有效的DNA修復[18-20]。

4.表觀遺傳學調控功能：USP7作為翻譯后蛋白穩定性調節因子的作用被廣泛接受。它可能以通過組蛋白H3K9的甲基轉移酶SUV39H1以表觀遺傳學機制調控p53靶蛋白[21]。USP7是控制組蛋白H2A泛素化水平的非典型多梳抑制復合體1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的組分之一[22]。有研究顯示,延伸蛋白BC和多梳抑制復合物相關蛋白EPOP能夠通過招募USP7調控H2B泛素化水平,參與癌癥增殖調控[23]。這些研究為USP7調控組蛋白標記的結構提供了更清晰的解釋。

E3連接酶泛素樣含PHD和環指域(ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1,UHRF1)是DNA甲基化機制的重要組成部分,能夠結合半甲基化的CpG島并招募維持甲基轉移酶DNMT1,以確保DNA甲基化模式通過復制傳播[24]。UHRF1、USP7和DNMT1還可以作為泛素E3連接酶-USP7靶復合物在已知的抑癌基因啟動子處形成,通過增加DNA甲基化和組蛋白修飾來抑制它們[25]。提示了USP7表觀遺傳調控和DNA修復兩大功能之間存在聯系。

三、USP7與結直腸癌

1.USP7在結直腸癌中的研究進展：正如上文所述,USP7具有廣泛且迥異的生物學功能,使得其在結直腸癌(CRC)中的表現也呈現出顯著的差異,在CRC中像“雙刃劍”一樣,即USP7既可以促進腫瘤生長,又可以抑制腫瘤生長。

Kerstin等[26]的研究顯示,USP7既具有促癌效應,又具有抑癌效應：在無應激的癌細胞中,無論上調還是下調USP7均能穩定p53,從而導致抑制細胞生長并誘導凋亡。體內實驗也證實,USP7上調或下調,都使腫瘤的體積和重量下降,腫瘤生長抑制。有研究表明,USP7的上調所帶來的生長抑制效應可能源于其穩定了p53,同時激活p53依賴的凋亡途徑;而USP7下調所帶來的生長抑制效應則較為復雜,因為其效果依賴于p53、MDM2和USP7相對化學計量,當USP7部分減少時可使p53失活,而USP7接近完全消失時則由于MDM2的失穩定性而使p53趨于穩定。總而言之,在CRC中,USP7下調所帶來的p53依賴和p53獨立同時存在的生長抑制作用,表現為促增殖蛋白的減少和抗增殖蛋白的增加。

Yang等[27-28]通過實時PCR和蛋白質印跡分析了25例結腸癌及癌旁組織中USP7表達,發現USP7在癌組織中顯著下調,同時還觀察到癌組織中磷酸化STAT3的表達升高。隨后在結腸癌細胞系HCT116、SW620和SW480中發現,磷酸化STAT3增多時,USP7的表達水平會降低,同時內源性p53蛋白水平下降。通過熒光素酶報告和芯片分析發現STAT3與USP7啟動子區域結合導致組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC 1)招募抑制USP7活性進而使內源性p53蛋白水平降低,導致腫瘤生長。Choi等[29]研究發現,FAM188B的mRNA和蛋白水平在結腸癌細胞系(HCT116,SW620,HT-29)中均有較高的表達。FAM188下調可以通過細胞周期阻滯或細胞死亡導致體外細胞生長抑制,這一過程的機制是：FAM188B的沉默激活了p53,從而上調凋亡相關基因導致細胞死亡。這種效應是通過與USP7相互作用來調控p53的穩定性。FAM188B中存在USP7結合基序,當FAM188B過表達時,會使得其結合的USP7顯著增加,導致泛素化的p53增多,使p53凋亡途徑被抑制;反之,當FAM188B表達下調時,游離的USP7增多,使得p53上調,激活p53凋亡信號通路,抑制腫瘤生長。總而言之,FAM188B的發現為USP7-MDM2-p53軸增添了新的內容。

在促進癌癥進展的研究中,Novellasdemunt等[30]在APC突變SW480細胞系中發現,敲減USP7會使CRC細胞的生長受限。隨后將SW480細胞系導入免疫缺陷模型鼠(SCID mice)中,構建異種移植模型,結果表明,USP7特異性抑制劑P2207對小鼠腫瘤生長有明顯的抑制作用,分離瘤體顯示出對Wnt靶基因的抑制,這種效應與敲減USP7一致,并且在APC突變的細胞中更為明顯。該研究顯示了USP7促進CRC發展的機制：APC突變的CRC細胞中Wnt活化和轉化的閾值-β-catenin抑制結構域(β-catenin inhibitory domain ,CID)缺失,使得β-catenin暴露于USP7下,放大了USP7對β-catenin去泛素化效應,導致Wnt信號的異常激活,促進了細胞增殖和腫瘤進展。

有關USP7抑制劑的研究也進一步證實了USP7所帶來的促癌效應。Du等[37]發現,結腸癌中USP7與DNMT1的豐度相關(R2=0.84)。USP7敲減的結腸癌細胞對組蛋白去乙酰化酶HDAC抑制劑更敏感：相較于正常細胞系,USP7敲減的細胞中HDAC抑制劑可以誘導5～10倍的細胞凋亡,增加了凋亡細胞標志物的豐度,包括caspase3,6,9和PARP。An等[31]發現與正常細胞相比,USP7在CRC細胞系HCT116,SW480,Caco-2,SW620 and HT-29中高表達。減少USP7的表達可以有效抑制CRC細胞系HCT116,SW480,Caco-2的增殖,由于三種細胞系中p53的狀態差異大,表明這種效應是非p53依賴性的。有數據分析顯示,CRC病人的總體生存率與USP7水平呈現顯著負相關,低表達USP7的病人顯示出相對增加的無復發生存的可能性。隨后使用USP7抑制劑P5091處理細胞,顯著抑制了細胞生長,增加了細胞凋亡,這與β-catenin降解有關。P5091能夠增加β-catenin的泛素化從而加快其降解,顯著降低β-catenin的水平,抑制了Wnt/β-catenin通路的異常激活,誘導了凋亡途徑。隨后的裸鼠異種移植實驗證實,使用P5091治療的裸鼠腫瘤的直徑和重量都明顯降低,并且荷瘤小鼠的體重沒有明顯下降,顯示出較好的耐受性。總而言之,P5091的處理在體內和體外均能通過抑制Wnt/β-catenin通路來抑制CRC的增殖。研究表明,USP7抑制劑在CRC中的顯著作用,進一步開發和完善有助于CRC的靶向治療。

2.USP7在結直腸癌中的研究方向

正如上文所述,USP7的生物學功能廣泛,普遍參與細胞調節,尤其是調節信號通路相關因子。已有的研究闡明了USP7如何調節Wnt/β-catenin、JAK/STAT等信號通路相關因子以促進CRC的進展,未來探究其他通路中USP7與CRC的關系將是一個方向,例如,目前研究已經證實Hippo通路與CRC的發展密切相關[32],而且已有研究人員證實USP7穩定該通路的轉錄因子Yki,促進肝細胞癌的發展[33]。上文提到USP7通過去泛素化可以調節NOTCH通路、Hedgehog通路、PI3K/Akt通路的相關轉錄因子,而這些通路廣泛參與癌癥的發生和發展,提示我們研究USP7如何通過這些通路促進CRC的進展。

另外,關于非編碼RNA協同USP7在腫瘤中研究逐漸增多,如上文所示的miR-205與USP7的關系,最近的研究也顯示在體脂較高的肝細胞癌病人中,由脂肪細胞分泌的外泌體中的環狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)上調,通過抑制microRNA-34a(miR-34a),激活USP7,導致一組基因上調,包括細胞周期蛋白cyclin A2,促進腫瘤增殖和轉移[34]。也有研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNA)可以通過USP7蛋白介導Wnt/β-catenin通路促進結直腸癌的發生[35],這也為USP7在結直腸癌的研究中提供了新的方向。

四、結語

USP7具有廣泛的表達調節,其主要底物不僅涉及經典的腫瘤抑制因子,如p53和PTEN,還涉及各種信號通路分子,如Yki、Ci/Gil、NOTCH1、β-catenin等,還參與細胞分裂、細胞分化、DAN損傷修復及表觀遺傳學的調控,使得USP7具有獨特的研究價值。