與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因篩選及其在骨骼肌組織中表達觀察

徐銳，李燕燕，徐紅

1 新疆維吾爾自治區人民醫院老年醫學中心，烏魯木齊 830000；2 新疆維吾爾自治區人民醫院心臟外科

隨年齡增加人類逐漸出現骨骼肌質量、肌力及功能的下降，這種在老年人群中普遍存在而又極易被忽視的臨床病征被稱為老年肌肉衰減綜合征，簡稱肌少癥。肌少癥患者常出現平衡能力下降、跌倒及骨折等，嚴重影響老年人的生活質量，同時給社會造成嚴重的經濟負擔。數據[1］顯示，2050年全世界肌少癥患者將超過5億。既往研究[2］認為，肌少癥的發生發展可能與運動神經元退化或丟失、蛋白質合成下降或異常、性激素水平降低、炎癥反應、氧化應激、肥胖、腸道菌群、胰島素抵抗、心力衰竭、及糖尿病等慢性消耗性疾病有關。最新研究發[3］現，肌少癥的發生與線粒體自噬相關。線粒體自噬是指線粒體通過自噬溶酶體系統降將功能障礙的線粒體進行降解，從而達到對線粒體的質量控制，避免機體受到線粒體損傷所帶來的不良后果[4］。線粒體自噬減弱后，受損的線粒體在細胞內囤積，產生大量的活性氧簇（ROS），激活泛素—蛋白酶體系統，最終影響骨骼肌的蛋白代謝，故線粒體自噬在骨骼肌的穩態平衡調控中發揮重要作用[5-6］。我們前期研究[7］發現，肌少癥大鼠的骨骼肌線粒體自噬信號通路 AMPK/ULK1 表達下調，線粒體自噬水平降低。但線粒體自噬在老年肌少癥發病中的確切病理生理機制仍不明確。因此，識別更多的與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因，有助于研究老年肌少癥發病的具體作用機制，從而對肌少癥進行早期診斷，進一步制訂個體化的診療方案。為此，2023年1—11月，我們基于數據庫數據篩選與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因，并觀察其在骨骼肌組織中的表達變化，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因篩選

1.1.1 肌少癥發病的差異表達基因篩選 在基因表達數據庫（Gene expression omnibus，GEO）搜索“肌少癥”，篩選得到GSE1428 和GSE136344 基因表達圖譜，GSE1428 基因表達圖譜（實驗平臺為 GPL96）包含10 例正常青年的骨骼肌組織和12 例肌少癥患者的骨骼肌組織轉錄組數據。GSE136344基因表達圖譜（實驗平臺為 GPL5175）包含11 例正常青年的骨骼肌組織和19 例肌少癥患者的骨骼肌組織的轉錄組數據。使用GEO2R 軟件匯總兩個GSE1428 和GSE136344基因表達圖譜中所有肌少癥發病的差異表達基因，使用R 軟件limma 包篩選肌少癥發病的差異表達基因（PValue＜0.05，∣logFC∣＞1）。

1.1.2 線粒體自噬相關基因篩選 以“線粒體自噬”為關鍵詞，從GeneCard 數據庫中進行檢索，篩選相關性評分＞1分的線粒體自噬相關基因。

1.1.3 與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因篩選 使用“VennDiagram”包將肌少癥發病的差異表達基因與線粒體自噬相關基因取交集，最終得到與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因。

1.2 與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因的生物學功能分析 使用R 軟件“clusterProfiler”包運用基因本體論（Gene ontology，GO）和京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因的生物學功能。 富集閾值設置為 FDR ＜ 0.05，并將富集結果進行可視化。GO 分析分別從生物過程 （Biological process，BP）、細胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）對差異基因進行富集。

1.3 與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因篩選 將與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因導入STRING 網站（https：//www. string-db. org），繪制差異表達基因的蛋白質互作網絡（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），置信度為 0.4（Confidence=0.4），去除離散的蛋白。

通過Cytoscape 軟件中的MCODE 插件對PPI 互作用網絡中的蛋白進行功能模塊分析。利用Cytoscape中的cytoHubba插件采用Degree算法對與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因進行賦分，選出排名前10 的基因即為與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因。

1.4 與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因驗證 用GSE136344基因表達圖譜為驗證數據集，收集與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因在肌少癥、健康查體者骨骼肌組織中的表達資料，采用ggplot2 包并繪制靶點基因功能相似的箱型圖驗證與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因篩選結果 從GEO2R 軟件中篩選肌少癥發病的差異表達基因2 242個，其中表達上調的基因30個、表達下調的基因2 212 個。從GeneCards 軟件中得到線粒體自噬相關基因845 個。二者取交集后最終得到與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因99 個，包括線粒體內膜蛋白基因（Inner membrane protein， IMMT）、動態蛋白1 樣蛋白基因（Dynamin 1 Like，DNM1L）、ATP 合酶F1 亞基α 基因（ATP Synthase F1 Subunit Alpha，ATP5A1）等。

2.2 與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因的生物學功能 KEGG 分析結果顯示，與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因主要富集于神經變性途徑—多種疾病（pathways of neurodegeneration-multiple diseases）信號通路、帕金森疾?。≒arkinson disease）信號通路、朊毒體?。╬rion disease）信號通路等。GO分析結果顯示，與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因主要富集在能量代謝、細胞呼吸、氧化磷酸化調節等生物學過程，主要定位于線粒體內膜、線粒體內部的大分子蛋白質復合物等，參與調節跨膜轉運活性等分子功能。

2.3 與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因篩選的結果及驗證 成功構建一個共有58 個節點、124 條相互作用線的與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因蛋白質的PPI 網絡圖（見圖1）。與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因為：線粒體內膜蛋白基因（Inner membrane protein，IMMT）、動態蛋白1 樣蛋白基因（Dynamin 1 Like，DNM1L）、ATP 合酶F1 亞 基α 基 因（ATP Synthase F1 Subunit Alpha，ATP5A1）、 ATP 合酶 F1 亞基β 基因（ATP synthase F1 β subunit，ATP5B）、細 胞 色 素C1 基 因（Cytochrome c-1，CYC1）、 泛醌氧化還原酶核心亞基 S1基因（Ubiquinone oxidoreductase core subunit S1，NDUFS1）、泛醌氧化還原酶亞基A9 基因（Ubiquinone oxidoreductase subunit A9，NDUFA9）、蘋果酸脫氫 酶1 基 因（Cytosolic Malate dehydrogenase 1，MDH1）、異檸檬酸脫氫酶3α 基因（Subunit of isocitrate dehydrogenase 3，IDH3A）、泛醌細胞色素c 還原酶復合物核心蛋白1基因（Ubiquinol-cytochromecreductase core protein 1，UQCRC1）。與正常骨骼肌組織相比，肌少癥患者骨骼肌組織中IMMT、DNM1L表達降低（P均＜0.05）。

圖1 與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因蛋白質的PPI圖

3 討論

我國已進入老齡化社會，老年肌少癥不僅嚴重影響患者生活質量，還成為當今社會的嚴重的社會問題。肌少癥發病機制尚不明確，有研究[3］顯示線粒體自噬參與肌少癥的發病。線粒體自噬功能紊亂是各種骨骼肌肉疾患的潛在病因之一，通過調節線粒體自噬能維持骨骼肌穩態，但線粒體自噬相關通路在骨骼肌中發病機制中的作用尚有爭議[9］。雖然許多研究在細胞或動物模型中顯示線粒體自噬對骨骼肌有保護作用，但大型臨床試驗[10］尚未能證明改善線粒體自噬治療在肌少癥中的效果。肌少癥的發病機制非常復雜，單一的機制無法解釋其生理病理學改變，因此尋找肌少癥患者線粒體自噬的相關生物學標志物，在進一步了解肌少癥組的發病機制及尋找治療方案中意義重大。

本研究采用生物信息學分析方法對GEO 數據庫GSE1428 數據集基因表達圖譜進行分析，篩選出99 個與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因。GO 富集結果顯示這些基因主要參與能量代謝、細胞呼吸、氧化磷酸化能量代謝等過程。KEGG富集分析結果顯示，目標蛋白主要參與神經變性途徑-多種疾病信號通路、帕金森疾病通路等，上述通路均涉及神經系統變性疾病。肌少癥與神經系統變性疾病均為老年人常見疾病，肌少癥與帕金森病的發病具有相關性，且相互影響。帕金森病合并肌少癥患者較不合并肌少癥者更易出現運動量減少、步態減慢、日常生活能力下降，這嚴重影響此類患者生活質量[11］。肌少癥與神經系統變性疾病常伴隨發生，提示兩種疾病可能存在有共同的發病機制，但尚不明確。有研究[12］顯示運動神經元的減少可能參與了兩種疾病的共同發病。本研究發現線粒體自噬有可能參與了肌少癥與神經變性疾病的共同發病，這為探索兩種疾病的共同發病機制提供一定的參考。本研究利用Cytoscape軟件對蛋白互作結果進行分析，利用插件 CytoHubba鑒定了10 個與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因。最終經過GSE136344 數據集驗證最終確定IMMT、DNM1L可能參與肌少癥的發病。

IMMT是是一種關鍵的跨膜蛋白編碼基因，在線粒體功能、蛋白質轉運、線粒體DNA 轉錄、三磷酸腺苷生成和細胞凋亡中起關鍵作用。IMMT下調、修飾或破壞將導致線粒體功能障礙和細胞死亡。IMMT與腫瘤、糖尿病心肌病、缺血再灌注等疾病的發生發展有關，目前尚無IMMT與肌少癥發病有關的相關報道[13-14］。本研究發現IMMT 為肌少癥發病的關鍵基因，這可能是因為IMMT 與線粒體功能障礙有關。DNM1L為GTP 酶動力蛋白超家族的一個成員，主要功能為編碼動力蛋白相關蛋白1（Dynamin-related protein 1，Drp1）。Drp1 是鳥苷三磷酸水解酶動力蛋白超家族的成員，能夠介導線粒體外膜分裂。此外，DNM1L還在很大程度上參與了線粒體自噬、運動、過氧化物酶體斷裂和細胞死亡[15-17］。有研究[18］顯示慢性腎功能不全患者常合并肌少癥，而慢性腎功能不全患者DNM1L含量明顯增高，這證實了DNM1L可能通過調節線粒體自噬參與了慢性腎功能不全患者肌少癥的發病。本研究顯示IMMT、DNM1L為肌少癥發病的關鍵基因，這可能是因為兩種基因均與線粒體功能密切相關，通過影響線粒體穩態參與肌少癥發病。

綜上所述，與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因共99個，與肌少癥發病相關的線粒體自噬差異表達基因可通過影響神經變性途徑—多種疾病信號通路、帕金森疾病信號通路、朊毒體病信號通路等，調控能量代謝、細胞呼吸、氧化磷酸化調節等過程，參與調節跨膜轉運活性等分子功能。肌少癥患者骨骼肌組織中ATP5A1、 ATP5B低表達。ATP5A1、 ATP5B可能為與肌少癥發病相關的線粒體自噬靶點基因。