LYVE1+巨噬細胞在RA患者關節滑膜組織中表達變化及對RA-FLS細胞遷移、侵襲、FMT的抑制作用

李驍瀚，王洪星，王璽龍，趙娜，劉治璞，張義

山東大學齊魯醫院檢驗科，濟南 250012

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要臨床特征為關節炎癥，可伴隨逐漸進展的關節損傷[1］。成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是一種間充質衍生細胞，可分泌滑液和關節軟骨的某些成分，參與滑膜的生理學功能。FLS是RA 滑膜炎癥和關節損傷的關鍵驅動因素[2］。與正常滑膜中FLS 相比，RA 滑膜中類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞（RA-FLS）的遷移、侵襲功能異常活躍[3］。在既往對于RA-FLS 的研究[4］常用人類風濕性關節炎成纖維細胞MH7A 替代RA-FLS 進行后續實驗。研究[5］發 現，RA 組 織 中RA-FLS/MH7A 的COL1A1、fibronectin、α-SMA 等FMT相關基因mRNA 相對表達量均升高，說明RA-FLS 成纖維細胞向肌成纖維細胞 轉 化（fibroblast-to-myofibroblast transformation，FMT）可能在RA的發生發展中發揮重要作用。既往研究[6］發現，RA 患者滑膜組織中巨噬細胞的豐度與關節損傷程度以及局部關節高疾病活動性評分呈正相關。淋巴管內皮受體-1（lymphatic vessel endothelial receptor-1，LYVE1）是透明質酸結合蛋白超家族的一員，基因全長2 313 個堿基，可翻譯成由322 個殘基構成的Ⅰ型完整跨膜糖蛋白，包含有212 個殘基構成的糖基化胞外區、21 個殘基組成的跨膜錨定區和63 個殘基構成的細胞質尾3 個部分[10］。LYVE1主要在淋巴內皮細胞[11］和巨噬細胞[12］中表達。最新[13］研究報道，相對于健康人及RA緩解期患者，RA患者滑膜組織中LYVE1+巨噬細胞，表達降低。既往研究僅發現LYVE1+巨噬細胞是一種傾向于M2表型的巨噬細胞，其在RA 發生發展中的具體作用機制目前尚未明確。為此，我們觀察了LYVE1+巨噬細胞在RA 患者關節滑膜組織中的表達變化及RA-FLS遷移、侵襲、FMT的抑制作用，探討LYVE1+巨噬細胞在RA 發生發展中的可能作用機制，旨在為RA 的治療提供新思路。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 RA、OA 患者滑膜組織LYVE1+巨噬細胞檢測

1.1.1 臨床資料 RA 與OA 患者滑膜組織均來源于2022年10月—2023年10月期間于山東大學齊魯醫院關節外科手術中切除的病變組織。由于無法獲取健康人的滑膜組織，本研究根據以往的RA 滑膜研究經驗，將OA 滑膜組織作為對照組[14］，并將受檢滑膜組織包埋于石蠟中保存。年齡（歲）：RA患者男14 例、女31 例，年齡（57.2 ± 4.31）歲，病程（6.00 ±2.74）年，C 反應蛋白77.50（58.43，88.39）mg/L，血沉150.51（84.51，211.78）mm/h，疼痛評分NRS 為4.5（2，7）分，RF191.56（92.40，264.78）IU/mL。OA患者中男23例、女22例，年齡55（59，72）歲，病程7（5，9）年，C 反 應 蛋 白4.87（2.73，8.01）mg/L，血 沉（6.43 ± 4.86）mm/h，疼痛評分NRS為3（2，4）分；RA與OA患者年齡性別比例等一般資料具有可比性。納入RA、OA 患者均簽署知情同意書，本研究獲得山東大學齊魯醫院倫理委員會批準（KYLL-202210-069-1）。

1.1.2 RA 與OA 患者滑膜組織LYVE1 與CD68 定位與定量檢測 采用免疫熒光（IF）染色法。觀察CD68 與LYVE1 標記物的顏色分布分析標記物在滑膜組織中的定位，通過收集、計算CD68 與LYVE1 標記物的熒光表達量分析被標記物在滑膜組織中的表達量。選擇兔源性抗人LYVE1 抗體與兔源性抗人CD68抗體對載玻片進行定位標記。使用Alexa Fluor 594結合的抗人抗體標記兔源性抗人LYVE1抗體和Alexa Fluor 488 結合的抗人抗體標記兔源性抗人CD68 抗體進行定量染色。使用蔡司Axio 立式熒光顯微鏡來拍攝圖像，將滑膜組織中CD68 的表達視為滑膜組織中巨噬細胞的表達[8］，LYVE1與CD68表達重疊位置視為LYVE1+巨噬細胞表達。ImageJ 軟件分別收集、計算滑膜組織中LYVE1 與CD68 的熒光強度，將熒光強度視為LYVE1 與CD68 在滑膜組織中的表達量。重復測算3次，取平均值。

1.2 LYVE1+巨噬細胞對RA-FLS 遷移、侵襲、向肌成纖維細胞轉化的抑制作用觀察

1.2.1 細胞、試劑及儀器 人單核細胞白血病細胞（THP-1 細胞，是一種單核細胞，能夠被佛波酯PMA誘導分化為巨噬細胞[9］）、人類風濕性關節炎成纖維細胞（MH7A 細胞）（ATCC，中國）；RPMI 1640 培養基、DMEM 高糖培養基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶和PBS（Gibco 公司，美國）；PMA（MCE，美國）；兔源性抗人LYVE1抗體、兔源性抗人CD68抗體（Proteintech，美國）；LYVE1過表達慢病毒（吉凱基因醫學科技股份有限公司，上海）；TRIzol 試劑、Fast SYBRGreen?Master Mix（ThermoFisher，美國）；RT-qPCR引物（捷瑞生物工程有限公司，上海）；培養瓶、6 孔板、24 孔板和Transwell 小室等（賽維爾生物科技有限公司，武漢）。

1.2.2 構建LYVE1+巨噬細胞 按照供應商提供的說明書操作，取對數生長期THP-1細胞，在培養液中加入LYVE1 過表達慢病毒，同時加入2 ng/mL 濃度的嘌呤霉素進行篩選，培養48 h，獲得表達LYVE1的THP-1 細胞。在表達LYVE1 的THP-1 細胞中加入100 ng/mL 的PMA 誘導培養48 h，即獲得LYVE1+巨噬細胞。由于THP-1 細胞本身不表達LYVE1，因此另取部分THP-1細胞，僅加入100 ng/mL的PMA 誘導培養48 h，獲得LYVE1-巨噬細胞。

1.2.3 LYVE1+巨噬細胞對MH7A 細胞遷移能力的影響觀察 采用劃痕實驗。取對數生長期MH7A細胞，用含10% FBS 的DMEM 高糖培養基培養至細胞生長融合至80%。用無菌塑料移液管尖端對細胞單層進行刮擦，PBS 洗滌2 次，將培養基更換為無血清的高糖DMEM 培養基。以3×104個LYVE1+/LYVE1-巨噬細胞（含有10% FBS的RPMI 1640完全培養基）分別加入不同的24 孔板Transwell 小室后分別插入劃痕操作后的MH7A細胞孔板中。在小室中分別加入LYVE1+巨噬細胞（LYVE1+巨噬細胞組）與LYVE1-巨噬細胞（LYVE1-巨噬細胞組），將僅含培養基的小室標記為空白對照組。分別在培養0、24 和48 h 取出培養室，Olympus CKX53 倒置顯微鏡下對各組MH7A 細胞劃痕進行觀察和拍照，ImageJ 軟件測算劃痕面積，計算各組細胞劃痕愈合比。劃痕愈合比=（初始劃痕面積-最終劃痕面積）/初始劃痕面積。重復測算3次，取平均值。

1.2.4 LYVE1+巨噬細胞對MH7A 細胞侵襲能力的影響觀察 采用Transwell 侵襲實驗。以3×104個LYVE1+/LYVE1-巨噬細胞（含有10% FBS 的RPMI 1640完全培養基）加入24孔板中。在小室中分別加入LYVE1+巨噬細胞（A 組）與LYVE1-巨噬細胞（B組），將僅含有的小室標記為C 組。將MH7A 細胞進行消化、收集，并使用不含血清的DMEM 高糖培養基進行重懸，24孔板Transwell小室中每小室加入3×104個MH7A 細胞，分別插入上述不同巨噬細胞分組的24 孔板中。24 h 后去除上室細胞，下室的細胞則為穿過小室濾膜的侵襲成功細胞。多聚甲醛固定與結晶紫染色小室濾膜，Olympus CKX53 倒置顯微鏡觀察小室濾膜并隨機拍照5 個視野，ImageJ 軟件統計穿膜細胞數。重復測算3次，取平均值。

1.2.5 LYVE1+巨噬細胞對MH7A 細胞FMT 轉化的影響觀察 采用實時定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）法。取對數生長期MH7A 細胞培養至細胞生長融合80%，分為一、二組，另選擇僅含有培養基小室為空白組。分別消化收集LYVE1+及LYVE1-巨噬細胞，使用含有10% FBS 的RPMI 1640 完全培養基重懸。一二組分別加入3×104個的LYVE1+巨噬細胞、LYVE1-巨噬細胞，培養48 h 移除Transwell 小室，吸棄24 孔板中培養基并用PBS 清洗MH7A 細胞3次，使用TRIzol試劑提取MH7A 細胞總mRNA，按照試劑商的指示在QuantStudio6 上使用Fast SYBR?Green Master Mix進行RT-PCR，以檢測各組MH7A 細胞FMT 相關基因（COL1A1、fibronectin、α-SMA）mRNA，以GAPDH 作為參考基因。COL1A1的上游引物為5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3'，下游引物為5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3'；fibronectin 上游 引物 為5'-CGGTGGCTGTCAGTCAAAG-3'，下游引物為5'-AAACCTCGGCTTCCTCCATAA-3'，α-SMA上游引物為5'-TCCATCGGAGCCGAAGAAATC-3'，下游引物為5'-CGGCTTCATCGTATTCCTGTT-3'；GADPH 上 游 引 物 為 5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'，下游引物為5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'。以2-ΔΔCT代表為COL1A1、fibronectin、α-SMA 的mRNA 相對表達量。FMT 相關基因mRNA 相對表達量越高，則該組MH7A 細胞FMT 過程越強，反之則該組MH7A 細胞FMT 過程越弱。重復測算3次，取平均值。

1.3 統計學方法 使用GraphPad Prism 9 統計軟件。用 Shapiro-Wilk test 方法進行正態分析，不符合正態分布的計量資料用中位數和四分位數M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗；符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用Student'st檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較使用Tukey多重比較檢驗法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RA 與OA 患者滑膜組織LYVE1、CD68 表達情況 RA 與OA 患者滑膜組織中LYVE1、CD68 表達位置基本重疊，說明LYVE1在RA與OA患者滑膜組織中主要表達在巨噬細胞上。RA 與OA 患者滑膜組織LYVE1 相對表達量分別為0.319 ± 0.033、1.000 ± 0.159（P＜0.05），CD68 相對表達量分別為1.044 ± 0.081、1.000 ± 0.099（P＞0.05）。

2.2 LYVE1+巨噬細胞對MH7A 細胞遷移侵襲與FMT過程的影響

2.2.1 各組細胞劃痕愈合比比較 培養24 h 時LYVE1+巨噬細胞組、LYVE1-巨噬細胞組與空白對照組 劃 痕 愈 合 比 分 別 為0.205 ± 0.006、0.362 ±0.015、0.462 ± 0.022，培養48 h 時LYVE1+巨噬細胞組、LYVE1-巨噬細胞組與空白對照組劃痕愈合比分別為0.508 ± 0.014、0.680 ± 0.025、0.810 ±0.119。與LYVE1-巨噬細胞組、空白對照組比較，培養24、48 h 時LYVE1+巨噬細胞組細胞劃痕愈合比低（P均＜0.05）。

2.2.2 各組細胞穿膜數比較 培養24 h 時A、B、C組穿膜細胞數分別為（157.67 ± 6.59）、（224.67 ±5.35）、（254.67 ± 9.25）個，與B 組、C 組比較，培養24 h時A組細胞穿膜細胞數少（P均＜0.05）。

2.2.3 各 組 細 胞 COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA 相對表達量比較 培養48 h時各組細胞COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA 相對表達量見表1。 與二組、空白組比較，培養48 h 時一組細胞COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA 相對表達量少（P均＜0.05）。

表1 培養48 h時各組細胞COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA相對表達量（± s）

表1 培養48 h時各組細胞COL1A1 mRNA、fibronectin mRNA、α-SMA mRNA相對表達量（± s）

組別一組二組空白組COL1A1 mRNA 0.506 ± 0.021 0.823 ± 0.025 1.000 ± 0.083 fibronectin mRNA 0.472 ± 0.028 0.755 ± 0.050 1.000 ± 0.077 α-SMA mRNA 0.487 ± 0.032 0.880 ± 0.021 1.000 ± 0.042

3 討論

RA滑膜關節中的巨噬細胞主要表現為M1型的促炎巨噬細胞與M2型的抗炎巨噬細胞。M1型巨噬細胞過度激活會破壞軟骨，M2型巨噬細胞則具有修補型特性。CHAKAROV等[15］研究表明，LYVE1+巨噬細胞被認為是一種傾向于M2表型的巨噬細胞，并且在RA滑膜中，M2巨噬細胞具備修復特性[16］。因此，我們猜測LYVE1+巨噬細胞與M2 型巨噬細胞修復RA關節的作用相似。在本研究中，通過對RA與OA患者滑膜組織中CD68與LYVE1進行IF染色證實了LYVE1 在滑膜組織中主要表達在巨噬細胞中，且LYVE1+巨噬細胞在RA患者滑膜組織中表達減少，這與先前的研究[13］一致，而調控巨噬細胞中LYVE1 表達下調的機制尚未明確，仍需深入研究。本研究認為LYVE1與RA的發生發展密切相關，在后續的研究中，將對于RA患者血清中的胞外域脫落LYVE1[17］的表達量進行檢測以及與RA 進展相關的指標如RF、抗CCP 抗體、das28 等進行相關性分析，評估LYVE1作為一種新型的血清學指標用于RA診斷的可行性。

FLS 在RA 關節損傷的發生發展中發揮重要作用。RA-FLS 表現出異常活躍的遷移和侵襲功能[3］。為了探究LYVE1+巨噬細胞對于RA-FLS細胞遷移和侵襲功能的影響，本研究通過通過劃痕實驗與Transwell 侵襲實驗觀察LYVE1+巨噬細胞對MH7A細胞遷移與侵襲功能的影響。在劃痕實驗中，LYVE1+巨噬細胞顯著抑制MH7A 細胞的遷移功能，并且在Transwell侵襲實驗中，LYVE1+巨噬細胞顯著抑制MH7A 細胞的侵襲功能。這表明LYVE1+巨噬細胞可以抑制MH7A 細胞的遷移與侵襲功能，其機制可能與LYVE1+巨噬細胞的抗炎特性尤其是TNF-α的下降有關[18］。抗炎環境可以抑制RA-FLS 細胞的侵襲性改變，炎癥環境中TNF-α 是影響RA-FLS 遷移與侵襲能力的關鍵因子，然而LYVE1+巨噬細胞是否通過影響TNF-α 影響RA-FLS 細胞的遷移與侵襲功能還需進一步研究。

RA 的進展與FLS 的FMT 過程有關，RA 患者關節整張損傷程度與RA-FLS的FMT過程呈正相關[5］，其具體表現為RA-FLS 中的COL1A1、fibronectin、α-SMA等相關基因mRNA的表達增高。本研究通過RT-qPCR 探究LYVE1+巨噬細胞對MH7A 細胞FMT相關基因mRNA 表達的影響。結果顯示，LYVE1+巨噬細胞明顯抑制MH7A 細胞FMT 相關基因mRNA的表達，這表明LYVE1+巨噬細胞可以抑制MH7A 細胞的FMT 過程。TGF-β 有明確促進FMT 過程的功能，在我們前期研究中發現，相較于LYVE1 高表達的巨噬細胞，LYVE1低表達的巨噬細胞分泌更TGFβ 的能力明顯增強。因此，LYVE1+巨噬細胞TGF-β能力下降的原因或許是影響RA-FLS 的FMT 過程的具體機制。

綜上所述，相比于OA 患者，RA 患者滑膜組織LYVE1+巨噬細胞少。LYVE1+巨噬細胞可抑制RA-FLS 的遷移、侵襲及FMT。LYVE1+巨噬細胞可能在RA的發生發展中發揮重要作用。