非小細胞肺癌組織中組蛋白去乙?；?、泛素特異性肽酶10的表達變化及其意義

張帆，楊鵬，郝振葉，巨寬心，李頡

1太原鋼鐵（集團）有限公司總醫院呼吸內科，太原 030008；2太原鋼鐵（集團）有限公司總醫院風濕免疫科

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，全球每年新增患者182.5 萬例、死亡約159 萬例[1］。非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer， NSCLC）是最常見的肺癌類型，可分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌。以手術治療為主的綜合治療是目前臨床常用的NSCLC治療方法，但由于NSCLC 的腫瘤異質性較高，相同分期或不同治療方法的患者療效及預后差異較大[2］。因此，研究NSCLC發生發展的具體機制，尋找準確評估患者預后的腫瘤標志物，指導臨床治療方案的選擇，具有重要臨床意義。組蛋白去乙酰化酶7（histone deacetylase 7，HDAC7）屬于組蛋白去甲基化蛋白酶家族成員，參與轉錄調控、細胞周期進展和細胞發育分化等過程。近年研究發現，黑色素瘤[3］、結直腸癌[4］等腫瘤中HDAC7能夠通過上調c-Myc等癌基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖和轉移。泛素特異性肽酶10（Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 10，USP10）是半胱氨酸蛋白酶家族成員，能特異性地切割結合蛋白質的泛素分子，參與細胞周期調控、自噬、增殖、遷移及耐藥等[5-7］。目前NSCLC 組織中HDAC7、USP10 表達相關研究報道較少。為此，我們觀察了NSCLC 組織中HDAC7、USP10 表達變化，探討其臨床意義，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018 年4 月—2020 年4 月我院收治的NSCLC 患者98 例。納入標準：①原發性肺癌，經CT 引導下肺穿刺活檢術后病理明確診斷為NSCLC，后經全身評估為早到中期，由我院呼吸科轉入胸外科進一步手術治療，術中保留癌組織及癌旁組織（距離癌組織5 cm 以上的正常肺組織），術后按《中國臨床腫瘤學會肺癌診療指南》推薦給予標準化化療4～6 個周期；②術前患者未接受任何治療；③患者均已簽署知情同意書；④臨床資料完整。排除標準：①有其它惡性腫瘤病史；②有結核病史、免疫系統疾病及其它嚴重感染；③合并心、肺、肝、腎等臟器異常；④有精神疾病病史。98 例患者中男58例、女40 例；年齡34～78（65.17 ± 6.19）歲；病理類型為腺癌62 例，鱗狀細胞癌36 例；TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期63 例，Ⅲ期35 例；腫瘤高中分化56 例，低分化42 例；淋巴結轉移33 例。本研究已通過醫院倫理審查。

1.2 NSCLC 癌 組 織 癌 旁 組 織HDAC7、USP10 檢測 采用免疫組織化學法。將NSCLC 癌組織和癌旁組織10%組織固定液固定16 h，石蠟包埋切片，厚度為3 μm，70 ℃溫箱內溶蠟2 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫苯處理，檸檬酸鹽溶液中高壓鍋抗原熱修復。自然冷卻后用3%雙氧水室溫避光孵育15 min。3%羊血清封閉2 h。滴加HDAC7、USP10一抗后（購自美國abcam 公司，貨號ab137366，ab109219），濃度為1∶200，4 ℃孵育過夜。滴加兔/鼠通用型二抗室溫孵育30 min。所有切片在室溫下用DAB 顯色5 min，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，晾干后中性樹脂封片。顯微鏡拍照（日本奧林巴斯公司，型號SPM-20）。以已有的HDAC7 和USP10 結腸癌陽性膜片作為陽性對照，反應過程中用磷酸鹽緩沖液替換一抗作為陰性對照。由兩位病理醫生在同一顯微鏡下觀察染色結果，有爭議時討論做出判斷。NSCLC 癌組織中HDAC7，USP10 棕黃色陽性表達主要位于細胞質和細胞膜，部分位于細胞核。在400×的高倍光學顯微鏡物鏡下，隨機選取5 個高倍視野，取每個視野的平均值作為陽性細胞的百分比，陽性細胞的百分比標準為：腫瘤細胞0%～5%染色計0 分、6%～30%染色計1 分、30%～60%染色計2 分、60%以上染色計3 分；染色強度標準為腫瘤細胞無染色計0 分、淺黃色計1 分、棕黃色計2 分、棕褐色計3 分。以陽性細胞的百分比與染色強度的乘積為最終評分，乘積≥2 分者判為陽性、＜2 分者判為陰性。

1.3 NSCLC 患者的隨訪方法 98 例患者術后均進行電話和門診隨訪。隨訪內容涵蓋患者生存情況、術后治療方案及近期復查結果等。隨訪3年，每3～6 個月隨訪1 次。隨訪截止至2023 年5 月。隨訪終點為患者死亡或隨訪結束。

1.4 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。計數資料用%表示，組間采用χ2檢驗；采用Spearman相關性分析法分析NSCLC 癌組織中HDAC7 與USP10 表達的相關性；采用Kaplan-Meier 生存曲線分析HDAC7、USP10 表達與NSCLC 患者預后的關系，以NSCLC 患者是否死亡為因變量，自變量包括HDAC7表達、USP10 表達、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM 分期；采用COX 多因素比例風險模型分析NSCLC 患者預后的影響因素。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 癌組織和癌旁組織HDAC7、USP10 陽性表達率比較 NSCLC組織、癌旁組織中HDAC7陽性率分別為65.31%（64/98）、6.12%（6/98）（χ2=74.756，P＜0.05）；NSCLC 組織、癌旁組織中USP10陽性率分別為63.27%（62/98）、8.16%（8/98）（χ2=64.800，P＜0.05）。

2.2 NSCLC 癌組織中HDAC7、USP10 表達的相關性 NSCLC 癌組織中HDAC7 與USP10 表達呈正相關（r=0.714，P＜0.05）。

2.3 不同臨床病理參數的NSCLC 患者HDAC7、USP10表達情況 不同臨床病理參數的NSCLC患者HDAC7、USP10 表達情況見表1。不同腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM 分期的NSCLC 患者癌組織HDAC7 和USP10 表達陽性率比較，差異具有統計學意義（P均＜0.05）。不同年齡、性別、病理類型及腫瘤直徑之間比較，差異無明顯統計學意義（P均＞0.05）。

表1 不同臨床病理參數的NSCLC 患者HDAC7、USP10表達情況（例）

2.4 不 同HDAC7、USP10 表 達 的NSCLC 患 者 預后情況比較 89 例患者隨訪過程中失訪2 例、死亡39 例，3 年總生存率為60.20%（59/98）。HDAC7陽性、陰性患者3 年總生存率分別為45.31%（29/64），88.24%（30/34）。USP10 陽性、陰性患者3 年 總 生 存 率 分 別 為43.55%（27/62），88.89%（32/36）。Kaplan-Meier 生存曲線分析結果顯示，與表達陰性者比較，HDAC7、USP10 陽性的NSCLC患者3 年累積生存率低（χ2=16.300、15.870，P均＜0.05）。

2.5 NSCLC患者預后的影響因素COX回歸 NSCLC患者預后的多因素COX 回歸分析結果見表2。COX 回歸分析結果顯示，HDAC7 陽性、USP10 陽性、腫瘤低分化程度、有淋巴結轉移、TNM 分期Ⅲ期是影響NSCLC 患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。

表2 NSCLC患者預后的多因素COX回歸分析結果

3 討論

NSCLC 早期癥狀不明顯，2/3 的患者確診時已處于晚期。盡管隨著醫療水平的提高，肺癌靶向治療和免疫治療的發展，肺癌患者的遠期生存預后仍然較差[8］。既往對NSCLC患者預后評估主要基于臨床特征、病理類型及腫瘤TNM 分期等，但由于腫瘤異質性，在判斷患者預后中的準確性不高[9］。深入研究NSCLC 疾病機制，探討NSCLC 預后影響因素，評估個體患者的生存期，對于改善患者臨床診治及延長生存時間具有重要意義。

組蛋白的乙?；?去乙?；揎検潜碛^遺傳學調控的重要機制，能夠多步驟、多層次調節染色質結構和基因轉錄[10］。HDAC7 是組蛋白去乙?；涪騛類家族成員，能夠通過與轉錄因子相互作用，募集到特定的基因區域發揮表達調控作用[11］。研究發現，HDAC7通過轉錄起始位點和超級增強子的組蛋白3賴氨酸27 乙?；揎?，促進腫瘤細胞干性特征維持，進而參與腫瘤細胞增殖及腫瘤的發生[12］。本研究中，HDAC7 在NSCLC 患者癌組織中表達升高，與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM 分期有關，表明HDAC7參與NSCLC的發生發展。研究表明，NSCLC腫瘤細胞中長非編碼RNA OPA 相互作用蛋白5 反義RNA1 能夠抑制微小RNA-140-5p 的表達，進而增加HDAC7 mRNA 的穩定性，導致HDAC7 蛋白表達升高，HDAC7 能夠誘導血管內皮生長因子A 的表達，促進淋巴管生成，促進腫瘤細胞的淋巴轉移[13］。另外，HDAC7是內皮祖細胞誘導的新生血管形成中的關鍵調節因子，促進腫瘤血管新生及腫瘤增殖轉移[13］。實驗研究[14］發現，敲除NSCLC 腫瘤細胞中HDAC7的表達后，腫瘤細胞外信號調節激酶去磷酸化，抗血管生成基因如內皮抑素等的表達增加，進而抑制腫瘤血管管腔的形成。本研究中，HDAC7陽性NSCLC 患者預后較差，提示HDAC7 是新的評估NSCLC 預后的腫瘤標志物。分析其原因，可能與HDAC7 參與促進化療耐藥性形成有關。研究[15］表明，HDAC7 與MYC 結合到人有機陽離子轉運蛋白OCT2 啟動子處，增加OCT2 啟動子基因處組蛋白3賴氨酸18 和27 位點的乙?；揎椝剑せ頞CT2的表達，導致腫瘤細胞對奧沙利鉑等化療耐藥性的形成。利用HDAC7 抑制劑TMP195 能夠誘導布魯頓酪氨酸激酶的高乙酰化，增強單核細胞衍生的巨噬細胞的抗腫瘤效應，增強慢性淋巴細胞白血病患者抗體治療的有效性[16］。因此，HDAC7的表達促進NSCLC 腫瘤的發生發展，是評估患者預后的腫瘤標志物，以HDAC7 為靶點的治療是潛在的NSCLC 治療方案。

USP10 是去泛素化酶家族成員，能夠將細胞質中多種蛋白去泛素化，調節細胞增殖、凋亡及自噬。研究報道，USP10在肝癌[17］、前列腺癌[18］等多種腫瘤組織中高表達，其通過幫助中細胞從上皮性表型轉化為間充質細胞，提高腫瘤細胞轉移、侵襲能力。本研究中，NSCLC 中USP10 表達升高，提示USP10 參與NSCLC 的腫瘤進展。NSCLC 中USP10 的表達上調與缺氧有關。缺血缺氧狀態可導致腫瘤組織缺氧誘導因子1α 轉錄上調，進一步上調USP10 的表達，USP10 能夠阻止抑癌因子p53 進入腫瘤細胞核，促進 腫 瘤 惡 性 進 展[19］。本 研 究 中，USP10 表 達 與NSCLC 患者的不良臨床病理特征有關，表明USP10促進NSCLC 腫瘤進展。研究發現，惡性腫瘤中的c-Myc 可誘導USP10 的轉 錄，介導p14ARF 的去泛素化，增強p14ARF 蛋白的穩定性，促進腫瘤細胞的發生及惡性轉化[20］。此外，USP10 能夠直接與Yes 相關蛋白/TAZ 相互作用，通過去泛素化來穩定Yes 相關蛋白/TAZ，激活下游c-myc 等癌基因的表達，促進肝細胞癌等惡性腫瘤的增殖和轉移[6］。在本研究中，USP10 陽性表達的NSCLC 患者預后較差，表明USP10 是新的評估NSCLC 預后的腫瘤標志物。研究發現，USP10 能夠與組蛋白去乙酰化酶6 相互作用，促進P53 基因突變的NSCLC 腫瘤細胞對順鉑等鉑類化療藥耐藥性形成，導致患者不良預后[21］。有 學 者[22］報 道，USP10 的 特 異 性 抑 制 劑Spautin-1 能夠抑制黑色素瘤細胞凋亡，促進活性氧介導的DNA 損傷，與順鉑等化療藥物發揮協同抗腫瘤效應。本研究顯示，NSCLC 中HDAC7 與USP10 表達呈顯著正相關，提示兩者可能存在相互作用關系。有學者[23］證實，NSCLC 中USP10 能夠與促進HDAC7 去泛素化，增強HDAC7 的穩定性，HDAC7 一方面通過上調成纖維生長因子18 的表達，促進NSCLC 腫瘤細胞的增殖。另一方面與β-連環蛋白的相互作用，降低β-連環蛋白Lys49 的乙?；?，促進β-連環蛋白的核轉移，增強腫瘤細胞的侵襲和遷移。

本研究中，低分化程度是影響NSCLC 患者預后的獨立危險因素。低分化的NSCLC 腫瘤細胞惡性程度高，增殖能力強，腫瘤生長速度快，腫瘤容易侵犯周圍組織，發生血管及淋巴結轉移，導致患者不良預后。NSCLC 患者淋巴結轉移是影響NSCLC 患者預后的重要因素，這與既往研究中淋巴結清掃的數量和范圍能夠顯著改善早期NSCLC 患者的無復發生存率和總生存率的結果一致[24］。TNM 分期系統是臨床上預測NSCLC 患者預后的重要依據，對于TNM 分期Ⅲ期NSCLC 患者，腫瘤負荷大，腫瘤細胞的侵襲和轉移能力強，術后腫瘤復發和轉移的風險較高，患者遠期生存預后較差。

綜上所述， NSCLC 癌組 織 中HDAC7、USP10表達升高，HDAC7、USP10 陽性表達與NSCLC 患者的不良臨床病理特征及不良預后有關。HDAC7、USP10 可能作為新的NSCLC 預后相關腫瘤標志物。但本研究納入樣本量較小，未對不同臨床病理特征的NSCLC 患者進行分層分析，也未深入研究HDAC7、USP10 在NSCLC 發展中的具體作用機制，未來需要進一步的基礎和臨床實驗進行探索。