黃芩素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 侵襲、遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用及其機(jī)制

陳林，梁秋果，吉楊丹，王恒

1 黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，貴州都勻 558013；2 黔南州天然產(chǎn)物與組分功效重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均呈年輕化趨勢(shì)發(fā)展，并逐年上升[1］。乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生惡性增殖后易形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移后患者的生存率明顯降低[2］。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程[3］。在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其主要的特征為細(xì)胞黏附分子E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)減少、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白（Vimentin）細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等[4］。整合素av及整合素β3為整合素家族成員之一，是指細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞膜表面的一類跨膜粘附分子，其在成熟血管內(nèi)皮、上皮細(xì)胞及正常細(xì)胞中表達(dá)較低或無(wú)表達(dá)[5］，但在肺癌、黑色素瘤和乳腺癌等[6-8］多種腫瘤細(xì)胞或組織中均呈高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究[9］發(fā)現(xiàn)，整合素αv 及整合素β3 高表達(dá)能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，反之，抑制整合素αv 及整合素β3 表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究[10］發(fā)現(xiàn)，整合素αv 及整合素β3 的異常活化會(huì)激活黏著斑激酶（FAK），活化的FAK 使下游磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞粘附和頂端基底外側(cè)的喪失，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力。黃芩素（Bai）是中藥黃芩的主要活性單體成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化應(yīng)激及抗血栓等多種藥理學(xué)作用[11-12］。最新研究[13］發(fā)現(xiàn)，黃芩素具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性，且不良反應(yīng)較小。黃岑素是否能抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移，目前相關(guān)研究較少。為此，我們觀察了黃芩素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231侵襲、遷移及EMT 的影響，并進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 MDA-MB-231 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞生物研究所，用DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加了10%胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco）、1%的100 U/mL青霉素（美國(guó)Gibco）和1%的100 μg/mL鏈霉素（美國(guó)Gibco）。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃和5%CO2。Fibronectin（FN，#F2006）和黃芩素購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；Cyclo（-RGDfK）購(gòu)自上海威環(huán)生物科技有限公司；Matrigel（#356237）購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences 公司。培養(yǎng)基DMEM/F-12 和胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）來(lái)自美國(guó)Hyclone 公司。SDS-PAGE 凝膠制備試劑購(gòu)自北京Solarbio 公司。抗 體：E-cadherin（R868）、vimentin（I444）、P-FAK（#BS4684）、phosphorylated-PI3K（#AP0152）、PI3K（Y46/Y199）、GAPDH（1A6）、goat anti-mouse IgG HRP（BS12478）和goat anti-rabbit IgG HRP（BS13278）購(gòu)自美國(guó)Bio-World 公司。Anti-integri alpha V（EPR16800）（ab179475）抗 體 購(gòu) 自Abcam 公 司。Anti-integri β3（B-7）（sc-46655）、FAK（#sc-557）抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 MDA-MB-231細(xì)胞分組及黃岑素給予方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 MDA-MB-231 細(xì)胞，培養(yǎng)在12 孔培養(yǎng)板中，直至90%的密度。將MDA-MB-231 細(xì)胞分為一組、二組、三組及對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔，一組、二組、三組分別加入2.5、5、10 μmol/L的黃岑素，對(duì)照組不做任何處理，培養(yǎng)48 h備用。

1.3 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力觀察 培養(yǎng)48 h 時(shí)取各組細(xì)胞，采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察四組細(xì)胞遷移能力、采用Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)觀察四組細(xì)胞侵襲能力。細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)：取四組細(xì)胞培養(yǎng)于12 孔培養(yǎng)板中。使用10 μL 的移液器吸頭板孔中間進(jìn)行劃傷，并在Leica DMI 1 顯微鏡下，以50×放大倍數(shù)拍照，分別在0、48 h 進(jìn)行拍照，并計(jì)算細(xì)胞遷移率（細(xì)胞遷移率 = 初始劃痕寬度- 48 h 后劃痕寬度/ 初始劃痕寬度×100%）。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel 膠（從-20 ℃拿出放在4 ℃解凍），按照說(shuō)明書的方法配置Matrigel膠，將其混勻后加到Transwell小室中，放入培養(yǎng)箱中（40 min），然后將制備好的Transwell 小室（8 μm 孔徑）轉(zhuǎn)移到含有10%FBS 的培養(yǎng)基的24 孔板中（1 mL/孔）。培養(yǎng)48 h 將各組細(xì)胞以5×105/mL 分別接種到Transwell 小室中（400 μL 細(xì)胞懸液），放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell 小室，棄去小室中的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕將Transwell 小室上層未侵襲的細(xì)胞蘸掉。4%多聚甲醛固定10 min，PBS 清洗，用HE 染液進(jìn)行染色。通過(guò)倒置顯微鏡（100×放大率）拍照，測(cè)算四組侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞vimentin、E-cadherin、整合素αv、整合素β3、FAK 及PI3K 檢測(cè) 采用Western Blotting法。培養(yǎng)48 h 時(shí)取四組細(xì)胞，用RIPA 裂解液（Lysis：PIC：PMSF=99∶1∶1）裂解收集細(xì)胞，4 ℃下12 000 r/min離心20 min。吸取上清液，轉(zhuǎn)移至事先預(yù)冷的EP 管中，即為提取的蛋白。按照BCA 蛋白測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行蛋白定量分裝，通過(guò)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，與整合素αv、整合素β3、p-FAK、FAK、p-PI3K、PI3K、E-cadherin、vimentin 的特異性一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，然后在室溫下與二抗孵育1.5 h。最后，使用ChemiDoc XRS +系統(tǒng)和圖像實(shí)驗(yàn)室軟件（5.2版，Bio-Rad）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參，以蛋白條帶灰度值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24 統(tǒng)計(jì)軟件。采用K-S 檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 培養(yǎng)48 h時(shí)四組細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)比較見表1。

表1 培養(yǎng)48 h時(shí)四組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較（± s）

表1 培養(yǎng)48 h時(shí)四組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較（± s）

注：與對(duì)照組相比，*P ＜0.05；與一組相比，＃P ＜0.05；與二組相比，ΔP ＜0.05。

侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）1 632 ± 250 700 ± 50*＃373 ± 12*＃Δ 1 833 ± 252組別一組二組三組對(duì)照組細(xì)胞遷移率（%）0.71 ± 0.06*0.50 ± 0.05*＃0.39 ± 0.02*＃Δ 0.86 ± 0.05

2.2 各組細(xì)胞vimentin、E-cadherin 相對(duì)表達(dá)量比較 培養(yǎng)48 h 時(shí)各組細(xì)胞vimentin、E-cadherin 相對(duì)表達(dá)量比較見表2。

表2 培養(yǎng)48 h時(shí)各組細(xì)胞vimentin、E-cadherin相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

表2 培養(yǎng)48 h時(shí)各組細(xì)胞vimentin、E-cadherin相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

注：與對(duì)照組相比，*P ＜0.05；與一組相比，＃P ＜0.05；與二組相比，ΔP ＜0.05。

E-cadherin 177 ± 7*246 ± 14*＃344 ± 30*＃Δ 100 ± 12組別一組二組三組對(duì)照組vimentin 95 ± 13*54 ± 8*＃43 ± 9*＃Δ 100 ± 17

2.3 各組細(xì) 胞整合素αv、整合素β3、p-FAK 及p-PI3K 相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞整合素αv、整合素β3、p-FAK及p-PI3K相對(duì)表達(dá)量比較見表3。

表3 培養(yǎng)48 h時(shí)四組細(xì)胞整合素αv、整合素β3、p-FAK及p-PI3K相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

表3 培養(yǎng)48 h時(shí)四組細(xì)胞整合素αv、整合素β3、p-FAK及p-PI3K相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

注：與對(duì)照組相比，*P ＜0.05；與一組相比，＃P ＜0.05；與二組相比，ΔP ＜0.05。

p-PI3K 93 ± 6*49 ± 12*＃38 ± 14*＃Δ 100 ± 7組別一組二組三組對(duì)照組αv 93 ± 8 64 ± 12*＃53 ± 7*＃Δ 100 ± 4 β3 97 ± 10*48 ± 12*＃33 ± 6*＃Δ 100 ± 7 p-FAK 69 ± 10*50 ± 11*＃37 ± 9*＃Δ 100 ± 5

3 討論

乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是提高乳腺癌患者生存率的關(guān)鍵。乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移與EMT 密切相關(guān)[14］。腫瘤細(xì)胞的EMT 是癌癥惡化和轉(zhuǎn)移的主要推動(dòng)力，同時(shí)也是決定乳腺癌進(jìn)展程度的關(guān)鍵因素。在EMT 過(guò)程中，細(xì)胞經(jīng)歷從原有的粘附性、非流動(dòng)性、卵圓形上皮表型向可移動(dòng)、侵襲性長(zhǎng)梭形間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)變，伴隨E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin 和Snail的表達(dá)上調(diào)[15］。因此，抑制EMT 的發(fā)生成為阻止乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶點(diǎn)，有望顯著提高乳腺癌患者的存活率。深入研究和干預(yù)EMT 過(guò)程，尤其是通過(guò)調(diào)節(jié)E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snail等分子的表達(dá)，可能為開發(fā)更有效的治療策略提供重要線索，從而為乳腺癌的個(gè)體化治療和預(yù)防提供新的思路。

MDA-MB-231 是一種人三陰性乳腺癌細(xì)胞系，表現(xiàn)出極強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，常被用作乳腺癌研究的模型。這種細(xì)胞缺乏雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2，具有高度惡性的特征，使其成為探索癌癥侵襲機(jī)制和藥物治療策略的重要工具。因此，本研選用MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象。黃芩素對(duì)多種癌癥，包括乳腺癌，具有顯著的抗腫瘤作用[13］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠顯著抑制DA-MB-231細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)vimentin蛋白表達(dá)。該結(jié)果表明，黃芩素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移、侵襲以及EMT 相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)均具有顯著的逆轉(zhuǎn)作用，提示了黃芩素可能能作為預(yù)防乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛在藥物。

整合素是位于細(xì)胞表面的異二聚體粘附受體，參與調(diào)控細(xì)胞的多個(gè)生理過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、分化、粘附和遷移[16］。腫瘤細(xì)胞的遷移過(guò)程依賴于腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的附著，而這一關(guān)鍵過(guò)程主要由整合素家族的黏附分子介導(dǎo)[17］。特別是整合素αv 及整合素β3，在腫瘤細(xì)胞中相對(duì)于其在正常組織或細(xì)胞中的表達(dá)量顯著提高[5］。整合素αv 及整合素β3 在腫瘤細(xì)胞的EMT 過(guò)程和侵襲轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。高表達(dá)的整合素αv 及整合素β3 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而通過(guò)降低整合素αv 及整合素β3 的表達(dá)可以發(fā)揮抑制作用，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的EMT 過(guò)程，從而有效地抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力[8］。在本研究中，黃芩素能夠使MDA-MB-231 細(xì)胞中整合素αv和整合素β3蛋白表達(dá)下調(diào)，提示黃芩素可能通過(guò)調(diào)控整合素αv 及整合素β3 來(lái)影響乳腺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

整合素αv 及整合素β3 以配體特異性的方式激活細(xì)胞遷移和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，F(xiàn)AK 是這一過(guò)程中的重要蛋白[18］。FAK 是一種非受體酪氨酸激酶，作為整合素信號(hào)傳導(dǎo)的中心下游效應(yīng)物，參與胞內(nèi)多條信號(hào)通路的傳導(dǎo)，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。FAK 的磷酸化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 的發(fā)生和腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)[19］。FAK 和PI3K 是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 和轉(zhuǎn)移的共同途徑。研究[20］表明，磷酸化的FAK通過(guò)激活下游信號(hào)PI3K促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 的發(fā)生和遷移侵襲能力的增強(qiáng)。整合素激活FAK后，活化PI3K通路參與多種腫瘤的增殖、遷移和血管生成[21］。已有研究[8］表明，整合素αvβ3/FAK/PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)乳腺細(xì)胞癌EMT 的發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠抑制腫瘤細(xì)胞中P-FAK、P-PI3K磷酸化蛋白表達(dá)，表明黃芩素對(duì)整合素αvβ3/FAK/PI3K 信號(hào)通路的活化起到抑制作用。

綜上所述，黃芩素能在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的EMT過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的抑制作用，同時(shí)顯著降低了這些細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。其可能的作用機(jī)制可能與抑制整合素αvβ3/FAK/PI3K 信號(hào)通路有關(guān)。