高效液相色譜法測定家種連翹中山柰酚含量*

周 燦，劉忍陽，柯 靜，石金敏，趙利軍△，秦瑜蓉，張玲玲

（1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰 442000； 2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北十堰 442000；3. 湖北省十堰市鄖西縣椴樹埡藥材種植專業(yè)合作社，湖北十堰 442600）

連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果實(shí)，秋季果實(shí)初熟尚帶綠色時(shí)采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干，習(xí)稱“青翹”；果實(shí)熟透時(shí)采收，曬干，除去雜質(zhì)，習(xí)稱“老翹”；有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱功效［1］177-178。連翹中目前已分離鑒定的成分主要有苯乙醇苷類、木質(zhì)素類、酚酸類及其衍生物、黃酮類、萜類及揮發(fā)油類、C6-C2 天然醇及其苷類等，其中黃酮類成分包括山柰酚、槲皮素、異鼠李素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、橙皮苷、黃芩苷等，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用［2］。本研究中擬建立測定家種連翹中山柰酚含量的高效液相色譜（HPLC）法，以期為進(jìn)一步控制家種連翹的內(nèi)在質(zhì)量及開發(fā)利用其藥用價(jià)值提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，含CMB-20A 型控制器、DGU-20A5R型在線脫氣機(jī)、進(jìn)樣泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A 型柱溫箱、SPD-M20A 型紫外檢測器（日本Shimadzu 公司）；FA2004 型電子分析天平（上海天平儀器廠，精度為0.1 mg）；HH-S 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州智伯瑞儀器制造有限公司）；H1650-W 型高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

山柰酚對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為wkq17032203，含量≥98%）；連翹藥材，于2022年7月16日分別采自十堰市鄖西縣三官洞林區(qū)、上津鎮(zhèn)的8 個(gè)行政村（包括何家井村、三官洞村、蒿坪河村、馬家坪村、祖師殿村、孫家灣村、絞腸關(guān)村、伍峪坪村，各1批，編號(hào)為S1-S8），經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室張曉燕教授鑒定為正品；甲醇為色譜純，鹽酸、磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱（250 mm×4.6 mm，4.6 μm）；流動(dòng)相：甲醇- 0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：365 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取山柰酚對(duì)照品12.5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含0.5 mg 山柰酚的對(duì)照品溶液。取蒸鍋，加水至約10 cm 深，加熱至沸并達(dá)圓氣狀態(tài)［3］；取藥材樣品500 g，置蒸鍋內(nèi)，再次達(dá)到圓氣狀態(tài)后蒸制15 min，快速移出，瀝干水分，于50 ℃烘箱干燥36 h，取出，碾壓成粉，制成藥材樣品粉末，過2號(hào)篩；取約5.0 g，各4份，精密稱定，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）混合溶液25 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流1 h，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下2 種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰。理論板數(shù)按山柰酚峰計(jì)不低于3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

1. 山柰酚A. 對(duì)照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.KaempferolA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2，1，2，4，6，8，10 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇定容，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 5 355.5X+ 5 380.3（R2= 0.999 9，n= 7）。結(jié)果表明，山柰酚質(zhì)量濃度在0.01～0.5 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取供試品溶液（編號(hào)S5）適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.41%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（編號(hào)S8），分別于室溫下放置2，4，6，8，10，12 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為2.54%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（編號(hào)S8）6份，各5.0 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果的RSD為4.32%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品（編號(hào)S8）6 份，各5.0 g，精密稱定，分別精密加入山柰酚對(duì)照品1.4 g，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率［4］。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 樣品含量測定

取樣品S1 - S8 各5.0 g，平行4 份，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果含量分別為0.448 7，0.209 2，0.037 7，0.229 4，0.410 3，1.088 7，0.359 8，0.292 6 mg/g。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

預(yù)試驗(yàn)對(duì)山柰酚的光譜吸收進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果顯示，山柰酚在199，365，265，511，715 nm 波長處均呈最大吸收，且其吸收強(qiáng)度大小為199 nm ＞365 nm ＞265 nm ＞715 nm ≈511 nm；分別采用前3個(gè)波長對(duì)對(duì)照品和樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果以365 nm 為檢測波長時(shí)目標(biāo)峰峰形更好、分離度均更高且符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究中采用365 nm作為檢測波長。

3.2 樣品制備研究

預(yù)試驗(yàn)中，取同一采收期內(nèi)的連翹，分別采用蒸法和煮法加工，適宜溫度干燥后分別測定揮發(fā)油、連翹苷、連翹酯苷A含量及蒸液和煮制液中連翹苷和連翹酯苷A的含量，結(jié)果，蒸法樣品的各指標(biāo)均合格；而煮法樣品的揮發(fā)油含量不合格，連翹苷和連翹酯苷A含量雖合格但低于蒸法樣品；且蒸液中連翹苷和連翹酯苷A的含量均低于煮制液。再對(duì)煮法工藝和蒸法工藝分別進(jìn)行研究，以煮制時(shí)間、煮制加水量、干燥溫度及蒸制時(shí)間、干燥溫度為指標(biāo)進(jìn)行工藝考察，結(jié)果煮制品揮發(fā)油含量均不合格，而蒸制最佳工藝為蒸15 min，50 ℃干燥36 h。因此，本研究中采用上述最佳蒸制工藝進(jìn)行樣品制備。

3.3 樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)

預(yù)試驗(yàn)中對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)量考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，樣品間的雜質(zhì)、水分、總灰分及浸出物含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明其符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，具有均一性，且不影響山柰酚含量的檢測；各樣品的揮發(fā)油、連翹苷及連翹酯苷A 含量差異較大（P＜0.05），且與山柰酚含量呈同向變化趨勢，推測其可能與產(chǎn)地、海拔及采收期的影響有關(guān)，影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

結(jié)合2020 年版《中國藥典（一部）》［1］223及其他文獻(xiàn)［5-9］報(bào)道，本試驗(yàn)原計(jì)劃采用HPLC 法同時(shí)測定連翹中黃酮類成分槲皮素、異鼠李素和山柰酚的含量，但結(jié)果欠佳。一方面，異鼠李素含量太低（1.3 kg連翹浸膏中僅含3.4 mg［10］），低于本研究中所用儀器的檢測限；另一方面，槲皮素的供試品溶液穩(wěn)定性很差，室溫靜置12 h后峰面積減少了30.3%，這與文獻(xiàn)［11］報(bào)道結(jié)果不一致，即使采用了相同的供試品溶液制備方法，即甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）混合溶液加熱回流提取效果仍未提升；推測其可能與連翹組分性質(zhì)或pH［12］有關(guān)，或需采用超聲［13］、醇提酸水解［1］230等方法提取才能保證槲皮素含量的穩(wěn)定。

3.5 產(chǎn)地對(duì)山柰酚含量的影響

十堰市鄖西縣處于華北自然區(qū)域和華中自然區(qū)域之間，屬副熱帶北界大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，雨量適中，日照充足，無霜期長，氣候溫和，特別適合人類居住和動(dòng)植物生長［14］。但由于東西部跨度115 km，縣域內(nèi)錯(cuò)綜分布有眾多山、丘、谷、壩，局部地方還有巖溶（喀斯特）地貌，海拔落差大（1.57～1 853 m［15］），因此全縣氣候不均衡，特別是春季，雖氣溫回升快，但降水少，氣溫起伏不定，冷空氣活動(dòng)頻繁。本研究中的藥材樣品采自十堰市鄖西縣三官洞林區(qū)及上津鎮(zhèn)，兩地相隔約50 km，南北跨度約30 km，產(chǎn)地海拔426～1 246 m，同時(shí)受“倒春寒”天氣影響，各產(chǎn)地家種連翹的山柰酚含量存在一定差異。

3.6 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了測定湖北省十堰市鄖西縣不同產(chǎn)地家種連翹中山柰酚含量的HPLC法，該方法靈敏、可重復(fù)，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于家種連翹中山柰酚含量的測定，并為連翹質(zhì)量控制方法的優(yōu)化提供了參考；但需注意，該縣不同產(chǎn)地家種連翹中山柰酚含量差異較大。