吸入用乙酰半胱氨酸溶液自研藥非臨床安全性評(píng)價(jià)*

劉靜歡，孫立杰，楊 嫻△

（1. 石家莊四藥有限公司，河北石家莊 050000； 2. 河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050000；3. 河北省大容量注射劑工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050000）

乙酰半胱氨酸來(lái)源于蔥屬植物，為L(zhǎng)-半胱氨酸和抗氧化劑谷胱甘肽的前體，具有抗氧化、抗炎和黏液溶解作用，其常見劑型有顆粒劑、片劑、泡騰片、膠囊、霧化吸入劑等［1-3］。霧化吸入給藥劑量低、起效快，能直接作用于氣道，以達(dá)到較高的局部藥物濃度，已廣泛用于呼吸道疾病的治療［4］。吸入用乙酰半胱氨酸溶液［原研藥為Zambon SpA 公司的Fluimucil（富露施）］，臨床主要用于治療濃稠黏液分泌物過多的呼吸道系統(tǒng)疾病。《藥品注冊(cè)管理辦法》要求，申請(qǐng)藥品注冊(cè)時(shí)應(yīng)提供臨床前安全性等相關(guān)資料［5］，安全性實(shí)驗(yàn)是藥物研發(fā)過程中的基礎(chǔ)工作，其中對(duì)于霧化吸入給藥，呼吸道刺激性和主動(dòng)全身過敏反應(yīng)為較可能出現(xiàn)的安全問題［6］。因此，本研究中依據(jù)《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》和吸入用乙酰半胱氨酸溶液臨床擬訂用法用量，通過開展日本大耳白兔呼吸道刺激性實(shí)驗(yàn)和豚鼠主動(dòng)全身過敏實(shí)驗(yàn)，對(duì)吸入用乙酰半胱氨酸溶液自研藥進(jìn)行非臨床安全性評(píng)價(jià)研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

NE - C28 型壓縮式吸入器（日本Omron 公司）；BSA5201 - CW 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司，精度為0.1 g）；ASP300S型全自動(dòng)組織脫水機(jī)、HI210型攤片機(jī)、HI1220型烘干機(jī)、ST5020型多功能染色機(jī)、DM3000型生物顯微鏡、病理圖像分析系統(tǒng)（含DFC450 型攝像頭+ Leica Application Suite V4 圖像采集軟件），均購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2 試藥

吸入用乙酰半胱氨酸溶液（自研藥，某公司，批號(hào)為16052231，含量為100.8%；原研藥，批號(hào)為28 003128；規(guī)格均為3 mL∶0.3 g）；0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào)為2A15032901，規(guī)格為每袋100 mL∶0.9 g）；10%卵白蛋白溶液（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)為SLBL1882V，規(guī)格為每瓶250 g，臨用前加入適量氯化鈉注射液充分溶解并定容）；10%中性福爾馬林溶液（中國(guó)Biosharp 公司，批號(hào)為BL388A）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為G1120）。

1.3 動(dòng)物

普通級(jí)日本大耳白兔20只，雄性，檢疫結(jié)束剔除2只，用于實(shí)驗(yàn)前霧化速率測(cè)定；普通級(jí)Hartley豚鼠36只，雌雄各半，其中6 只用于檢疫剔除；均購(gòu)于北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)分別為SCXK（京）2011 - 0010，SCXK（京）2016 - 0007，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)分別為11402300002572，11402300002573。本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物及相關(guān)處置均符合動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品粒徑分析

檢測(cè)樣品粒徑分布，需符合供霧化器用的液體制劑要求。

2.2 呼吸道刺激實(shí)驗(yàn)［7-10］

2.2.1 方法

劑量設(shè)計(jì)依據(jù)：吸入用乙酰半胱氨酸溶液成人和兒童不區(qū)分劑量，臨床擬用最大量計(jì)算，即為10 mg/kg，日本大耳白兔折算系數(shù)為3.1［11］，故等效劑量為31 mg/kg，本次實(shí)驗(yàn)家兔一次給藥量按35 mg/kg計(jì)算。

分組及給藥：取18 只兔，給藥前稱定體質(zhì)量，據(jù)此按分層隨機(jī)化分組法分為陰性對(duì)照組（等體積0.9%氯化鈉注射液）、上市品對(duì)照組（原研藥0.1 mg/mL）和給藥組（自研藥0.1 mg/mL），各6 只，依次編為1-18 號(hào)，各組霧化吸入給予相應(yīng)藥物（35 mg/kg，0.35 mL/kg），每日上下午各1次，連續(xù)14 d。

觀察指標(biāo)：給藥前后觀察兔的外觀、行為、糞便等，每天觀察呼吸道刺激性4次，并記錄癥狀（如咳嗽）發(fā)生及恢復(fù)時(shí)間。分別于末次給藥24 h 及14 d 后，以2%戊巴比妥鈉（30～40 mg/ kg）靜脈注射麻醉，每組取3 只兔，以股動(dòng)脈放血的方法處死，解剖，肉眼觀察動(dòng)物口腔（唇、上顎、舌），鼻，咽，喉，氣管，支氣管，肺有無(wú)充血、紅腫等刺激性反應(yīng)。取上述組織器官，經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，切3～5 μm 厚片，HE 染色，顯微鏡下檢查病理形態(tài)。

2.2.2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間，各組兔外觀、行為、糞便等均正常，給藥后無(wú)咳嗽等癥狀。大體解剖后，除給藥組中1 只兔氣管內(nèi)見少量紅色液體外，其余兔的呼吸系統(tǒng)均未見明顯異常。末次給藥結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束后的病理學(xué)檢查中，3 組兔均出現(xiàn)刺激反應(yīng)。與陰性對(duì)照組和上市品對(duì)照組比較，給藥組未見藥物延遲或蓄積作用。詳見表1、圖1。

圖1 末次給藥24 h后實(shí)驗(yàn)兔肺及氣管的病理形態(tài)（HE，×10）Fig.1 Pathological morphology of lungs and trachea in rabbits after 24 h of the last administration（HE，×10）

表1 呼吸道刺激性試驗(yàn)組織病理學(xué)檢查結(jié)果Tab.1 Results of histopathological examination in the respiratory irritation test

2.3 主動(dòng)全身過敏實(shí)驗(yàn)［7-8，12-13］

2.3.1 方法

劑量設(shè)計(jì)依據(jù)：乙酰半胱氨酸溶液臨床使用劑量約為10 mg/kg，每日2次，豚鼠折算系數(shù)為4.6［11］，則豚鼠等效劑量為92 mg/kg，豚鼠的平均體質(zhì)量按400 g計(jì)算，每只豚鼠給藥劑量約為36.8 mg。

分組及給藥：取30 只豚鼠，檢疫期最后1 天稱定豚鼠體質(zhì)量，據(jù)此按分層隨機(jī)化分組法分為陰性對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射液0.8 mL/d），陽(yáng)性對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射液0.8 mL/d），上市品對(duì)照組［原研藥80 mg/d（0.8 mL/d）］，以及低劑量組［自研藥40 mg/d（0.4 mL/d）］和高劑量組［自研藥80 mg/d（0.8 mL/d）］，各6 只，雌雄各半。各組隔日致敏給藥（10%卵白蛋白溶液0.6 mL/d）1 次，共3 次。分別于末次致敏14 d 和21 d 后，每組分別取3 只豚鼠，按致敏劑量的2 倍進(jìn)行激發(fā)。致敏期間每日觀察豚鼠的癥狀；激發(fā)時(shí)，給藥后即刻至給藥后3 h詳細(xì)觀察豚鼠的反應(yīng)、癥狀的出現(xiàn)及消失時(shí)間。過敏反應(yīng)發(fā)生程度參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》全身致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［8］，實(shí)驗(yàn)中豚鼠出現(xiàn)不安寧、豎毛、發(fā)抖和搔鼻為過敏反應(yīng)弱陽(yáng)性，噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞和流淚為過敏反應(yīng)陽(yáng)性，呼吸困難、哮鳴音、紫癜、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、喘息、痙攣、旋轉(zhuǎn)和潮式呼吸為過敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，死亡為過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性。同時(shí)根據(jù)觀察結(jié)果計(jì)算過敏反應(yīng)發(fā)生率，并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2.3.2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間，各組豚鼠飲水、攝食及行為活動(dòng)正常，健康狀況良好，未出現(xiàn)與給藥相關(guān)的異常癥狀。低、高劑量組，上市品對(duì)照組及陰性對(duì)照組豚鼠激發(fā)后即刻至觀察結(jié)束均未見過敏反應(yīng)癥狀，過敏反應(yīng)均為陰性。僅陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠激發(fā)后出現(xiàn)不安寧（6/6）、咳嗽（3/6）、呼吸困難（4/ 6）、痙攣（6/ 6）、潮式呼吸（6/ 6）等不同程度的過敏反應(yīng)癥狀，并在激發(fā)后5 min 內(nèi)全部死亡；過敏反應(yīng)均呈極強(qiáng)陽(yáng)性（6/ 6）。表明豚鼠霧化吸入吸入用乙酰半胱氨酸溶液自研藥未發(fā)生全身主動(dòng)過敏反應(yīng)。

3 討論

制劑的原料和輔料及制備、貯存過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)均可能引發(fā)藥物毒性作用，進(jìn)而影響制劑的安全性［8］。吸入制劑在非臨床研究階段，以經(jīng)口鼻吸入給藥與臨床擬用途徑最接近［14］。本研究中將連有壓縮霧化器的噴霧面罩緊貼于大耳白兔與豚鼠口鼻部，開啟壓縮霧化器，進(jìn)行霧化吸入給藥，最大限度地模擬吸入用乙酰半胱氨酸的給藥方式。霧化給藥劑量通過給藥時(shí)間控制，使用分組后的剩余動(dòng)物模擬實(shí)際給藥過程，以測(cè)定霧化速率，根據(jù)霧化時(shí)間和溶液消耗體積計(jì)算出溶液霧化器平均噴霧速率，并據(jù)此計(jì)算霧化吸入給藥時(shí)間。其中，供試品的給藥劑量均根據(jù)臨床使用劑量與不同動(dòng)物間的折算系數(shù)進(jìn)行設(shè)計(jì)，且吸入劑量均高于臨床擬用最大劑量，可充分暴露藥物在使用中可能產(chǎn)生的局部和全身毒性。

吸入用乙酰半胱氨酸溶液對(duì)鼻咽和胃腸道有一定刺激作用。據(jù)報(bào)道，患者吸入富露施后出現(xiàn)胸悶、氣短癥狀［15］。本研究的主動(dòng)全身過敏實(shí)驗(yàn)中，低、高劑量組及上市品對(duì)照組豚鼠無(wú)任何呼吸困難、痙攣等過敏反應(yīng)癥狀。在呼吸道刺激性實(shí)驗(yàn)中，給藥結(jié)束期的陰性對(duì)照組、給藥組與上市品對(duì)照組大部分實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)鼻黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)、鼻腔炎性分泌物、咽喉表面炎性分泌物等輕微呼吸道刺激反應(yīng)，且病變程度無(wú)明顯差異。另外，部分動(dòng)物咽喉表面可見少量炎性分泌物，9 號(hào)兔（歸屬給藥結(jié)束時(shí)的上市品對(duì)照組）的氣管、支氣管黏膜固有層血管輕度擴(kuò)張充血，其余組織未見明顯組織病理學(xué)改變。呼吸道刺激性實(shí)驗(yàn)恢復(fù)期結(jié)束，陰性對(duì)照組、上市品對(duì)照組和給藥組實(shí)驗(yàn)兔仍可見鼻腔炎性分泌物、鼻黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但給藥組家兔鼻黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)、鼻腔炎性分泌物有一定程度的增加。另外，18 號(hào)兔（歸屬恢復(fù)期結(jié)束時(shí)的給藥組）的氣管、支氣管黏膜有輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺臟有輕微炎細(xì)胞浸潤(rùn)。綜合已有家兔呼吸道組織病理學(xué)背景資料，考慮該組織病理學(xué)改變主要和動(dòng)物自身的健康狀態(tài)有關(guān)。肺泡壁骨化生散在分布于陰性對(duì)照組、上市品對(duì)照組和給藥組家兔，且程度不做分級(jí)處理，為家兔的背景性病變。

綜上所述，乙酰半胱氨酸溶液自研藥對(duì)日本大耳白兔無(wú)明顯呼吸道刺激作用，對(duì)豚鼠無(wú)明顯的全身致敏作用。