冷凍調理小龍蝦生物保鮮劑的篩選及復配

孫英杰，孫榮雪，王成，馬艷弘，熊令明，劉錢媛，江寧*

（1.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

小龍蝦原名克氏原螯蝦，甲殼綱、十足目，因其獨特的風味、高蛋白和低脂肪含量等優點深受廣大消費者喜愛，是我國暢銷的淡水蝦類[1-2]。隨著小龍蝦消費量的迅速增長，小龍蝦加工品類日益多樣化、特色化，主要包括生鮮食品、冷凍初加工或低溫熟食制品等[3]。其中，冷凍調理小龍蝦因經簡單加工后便可食用而具有廣闊的發展前景。但冷凍處理只是抑制微生物繁殖及酶的活性，貯運過程的溫度波動、貯運時間等都會對小龍蝦產品品質造成不同程度的影響[4]。除此之外，冷凍調理小龍蝦在加工過程中使用大量油脂，產品在凍藏過程中易氧化加劇，最終引起產品劣變。

生物保鮮劑是一種綠色、安全且高效的新型保鮮劑，其主要從動物、植物和微生物中獲得[5]，具有綠色安全、殘留量低和保鮮能力強等特點，是現代食品保鮮的研究熱點。聚賴氨酸鹽酸鹽是鏈霉菌屬發酵過程中的代謝產物，經提取分離精制獲得，是一種具有廣譜抑菌性和熱穩定性的新型生物保鮮劑[6]。劉文浩等[7]研究發現，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽使用量在0.1～0.3 g/kg 范圍內，對弗氏檸檬酸桿菌屬的抑菌率達到100%。于曉慧等[8]選用茶多酚為主的生物保鮮劑處理小龍蝦后發現，樣品微生物數量和揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值的增長速率均有所降低，且在（25±1）℃貯藏條件下，貨架期由6 d 延長至15 d。迷迭香提取物具有高抗氧化活性，并且有相關研究表明，經含迷迭香提取物處理的雞肉餅保質期延長了4 d[9]。相關研究發現，將生物保鮮劑組合后應用于肉制品，能夠有效抑制其微生物生長和脂質氧化[10-11]。

本研究對7 種生物保鮮劑進行篩選，通過響應面法對篩選得到的生物保鮮劑進行復配，并對優化得到的復合保鮮劑保鮮能力進行驗證，以期為復合生物保鮮劑在延緩冷凍調理小龍蝦脂質氧化和品質劣變等方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦：淮安洪澤湖漁夫有限公司；腐敗希瓦氏菌：江蘇省農業科學院農產品加工研究所；聚賴氨酸鹽酸鹽（polylysine hydrochloride，PL）、茶多酚（tea polyphenols，TP）、迷迭香提取物（rosemary extracts，RE）、乳酸鏈球菌素（Nisin）、葡萄籽提取物、蘋果多酚、褐藻寡糖（Mw=2 800 Da）（均為食品級）；無水乙醇、醋酸鈉、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽[diammonium2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、過硫酸鉀、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；總抗氧化能力測定試劑盒：南京建成海浩生物科技有限公司

1.2 儀器與設備

M4PC 型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；XO-6D 無菌均質器：南京先歐儀器制造有限公司；SPARK 酶標儀：帝肯奧地利有限責任公司；5424R 高速冷凍離心機：湖南湘儀有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化有限公司；HZQ-F100 全溫度振蕩培養箱：太倉市華美生化儀器廠；SN-HWS-250B 恒溫恒濕箱：上海尚普儀器設備有限公司；LDZM-80L-I立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 冷凍調理小龍蝦的制備工藝

將新鮮小龍蝦刷洗干凈后置于碎冰中猝死，并于室溫下靜置1 h 以瀝干水分，隨后置于160 ℃油炸鍋中炸制2～3 min。將油炸后的小龍蝦加入鹵汁中煮制8 min。待小龍蝦鹵汁冷卻到80 ℃，加入不同濃度的保鮮劑并浸漬1 h，最后對小龍蝦進行真空包裝，經機械速凍后于-18 ℃冰柜中貯藏，備用。

1.3.2 生物保鮮劑體外抗氧化能力測定

經文獻查閱和前期預試驗發現，聚賴氨酸鹽酸鹽、乳酸鏈球菌素兩種抑菌劑的抗氧化能力極其微弱，因此不參與體外抗氧化能力的測定，僅對迷迭香提取物、茶多酚、蘋果多酚、葡萄籽提取物、褐藻寡糖5 種生物保鮮劑進行抗氧化試驗。

1.3.2.1 DPPH·清除活性

參考馬劍等[12]的方法，并略作修改。取50 μL 生物保鮮劑與150 μL 0.1 mmol/L DPPH 溶液混合均勻，室溫下避光放置30 min 后，測定其在517 nm 處的吸光度，以無水乙醇做空白對照。DPPH·清除率（X，%）計算公式如下。

式中：Ai為試驗組吸光度；Aj為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.2.2 ABTS+自由基清除活性

參考Feng 等[13]的方法，并略作修改。20μL 生物保鮮劑與180 μL ABTS+工作液，室溫避光反應60 min。以蒸餾水為空白對照，在734 nm 處測吸光度。ABTS+自由基清除率（Y，%）計算公式如下。

式中：A0為試驗組吸光度；A1為空白組吸光度。

1.3.2.3 總抗氧化能力總抗氧化能力參考總抗氧化能力測定試劑盒說明書的方法進行測定。

1.3.3 抑菌能力測試

參考Tian 等[14]的方法，取典型腐敗菌菌懸液0.1 mL涂布，使用打孔器在培養基上等距打孔，每孔中加入50 μL 生物保鮮劑進行抑菌能力測定，以無菌水為對照，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.3.4 單因素試驗

挑選鮮活、肢體無殘缺且大小均勻（18±2）g 的小龍蝦按照1.3.1 加工工藝進行處理。其中，單因素試驗使用的保鮮劑為經過抑菌能力和體外抗氧化試驗篩選所得（PL、RE、TP），處理組則不添加任何生物保鮮劑。各生物保鮮劑的最大限量標準參考GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[15]。單因素試驗以為硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS）值為指標，檢測方法參考GB 5009.181—2016《食品安全國家標準食品中丙二醛的測定》[16]中第二法測定。樣品每5 d 測定一次，15 d 為檢測終點。試驗重復3 次，結果取平均值。

1.3.5 響應面優化試驗設計

為進一步優化復合生物保鮮劑中各組分的添加量，在單因素試驗的基礎上，綜合選取作用效果最為明顯的3 個添加量為考察因素，根據Box-Behnken 試驗設計原理，設計三因素三水平試驗。檢測指標為貯藏15 d 后的TBARS 值、TVB-N 值，具體因素及水平如表1 所示。

表1 因素及水平編碼Table 1 Coded levels for factors in Box-Behnken design

1.4 冷凍調理小龍蝦貯藏期間理化指標測定

TVB-N 值：參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[17]中第三法進行測定。

TBARS 值：參考GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》[16]中第二法測定。

菌落總數：參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[18]測定。

1.5 數據處理

所有試驗均重復3 次，試驗結果取平均值，數據采用Origin 2021 與Design Expert V8 進行數據分析和圖表繪制。采用SPSS 26 進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 抗氧化劑能力測定

2.1.1 DPPH 自由基清除率

在有生物保鮮劑存在時，DPPH 的孤對電子被配對，使其吸收值透射率弱或者消失，從而量化其抗氧化能力[19]。不同生物保鮮劑DPPH·清除率見圖1。

圖1 不同生物保鮮劑DPPH·清除率Fig.1 Different bio-preservative of DPPH·radical scavenging rate

由圖1 可知，茶多酚、葡萄籽提取物表現出較強DPPH 自由基能力，添加量為0.062 5 g/L 時，自由基清除率分別達54% 和43%，高于其它生物保鮮劑的DPPH 自由基能力；迷迭香提取物DPPH 自由基清除效果受添加量影響較大，當添加量為1.5 g/L 時，茶多酚、葡萄籽提取物對DPPH 自由基清除率作用效果相當；而蘋果多酚與褐藻寡糖DPPH 自由基清除率較低且濃度依賴性較弱，與古紹彬等[20]所測蘋果多酚具有較強抗氧化作用有所差異，可能是由于蘋果多酚純度不同引起的差異。

2.1.2 ABTS+自由基清除率

ABTS 法測定生物保鮮劑的抗氧化作用主要是基于氫電子轉移機制，即抗氧化劑為自由基底物提供一個氫原子，產生非自由基底物和抗氧化劑自由基[21-22]。不同生物保鮮劑ABTS+自由基清除率見圖2。

圖2 不同生物保鮮劑ABTS+自由基清除率Fig.2 Different bio-preservative of ABTS+radical scavenging rate

由圖2 可知，保鮮劑添加量為1.0 g/L 時，茶多酚和迷迭香提取物ABTS+自由基清除率較高，可達到91.03% 和70.96%，這可能由于茶多酚和迷迭香提取物中的酚類物質能提供較多的氫原子。葡萄籽提取物ABTS+自由基清除活性受添加量影響較大，當生物保鮮劑濃度高于0.5 g/L 時，清除率大于迷迭香提取物。

2.1.3 總抗氧化能力

不同生物保鮮劑總抗氧化能力見圖3。

圖3 總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidant capacity

由圖3 可知，茶多酚總抗氧化能力較強，高于其它生物保鮮劑。同時，其它4 種物質具有劑量依賴性，總抗氧化能力均隨添加量升高而增強。褐藻寡糖與迷迭香提取物總抗氧化能力差異不大，且添加量超過0.5 g/L時，這兩種對總抗氧化能力影響較小。當葡萄籽提取物添加量小于1.0 g/L 時，其總抗氧化能力隨添加量增加而增強。

綜上所述，茶多酚和迷迭香提取物在低于最大允許添加量時，其DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、總抗氧化能力優于其它生物保鮮劑。因此，選擇這兩種生物保鮮劑作為抗氧化劑進行復合生物保鮮劑的復配。

2.2 抑菌能力測定結果

單一保鮮劑對腐敗希瓦氏菌的抑菌圈直徑見表2。

表2 單一保鮮劑對腐敗希瓦氏菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition zone of preservatives against Shewanella putrefaciens

由表2 可知，當乳酸鏈球菌素添加量低于4.00 g/L時，其對腐敗希瓦氏菌的抑菌效果不顯著且低于茶多酚，因而不作為抑菌劑參與單因素試驗；聚賴氨酸鹽酸鹽添加量為4.00 g/L 時，其抑菌圈直徑高達13.91 mm，相較于其它生物保鮮劑，對小龍蝦典型腐敗菌腐敗希瓦氏菌生長繁殖表現出最佳抑制效果。可能是由于聚賴氨酸鹽酸鹽改變了腐敗希瓦氏菌細胞膜通透性并破壞細胞壁，從而產生較大抑菌圈[6]。同時，茶多酚、迷迭香提取物所含有的酚類和黃酮類物質損傷通過腐敗希瓦氏菌的細胞膜，干擾菌體正常生命活動，達到優于蘋果多酚、葡萄籽提取物、褐藻寡糖的抑菌效果。結合抗氧化試驗結果，茶多酚、迷迭香提取物可與聚賴氨酸鹽酸鹽進行復配優化，可用于延長冷凍調理小龍蝦貨架期。

2.3 單因素試驗

丙二醛是脂質氧化的最終產物，丙二醛含量常用來反映機體氧化受損程度，其含量可用硫代巴比妥酸值表示。生物保鮮劑通過與脂質氧化過程中產生的金屬離子及自由基結合，抑制原料自氧化反應的進行[23]。因此，選用TBARS 值作為生物保鮮劑對冷凍調理小龍蝦脂質變化試驗的測定指標。

圖4 為不同PL 添加量對貯藏期間冷凍調理小龍蝦TBARS 值的影響。

圖4 不同PL 添加量對貯藏期間小龍蝦TBARS 值的影響Fig.4 Effect of different concentrations of polylysine hydrochloride on TBARS value of crayfish during storage

由圖4 可知，貯藏第15 天，各試驗組TBARS 值均低于對照組（1.733±0.142）mg MDA/kg。在相同貯藏時間下，TBARS 值隨PL 添加量的增加而減少，表明冷凍調理小龍蝦脂質氧化速率與PL 添加量呈正相關。但添加量為0.25 g/L 與0.30 g/L 差異不明顯，因而選擇PL 添加量0.15、0.20、0.25 g/L 進行響應面優化試驗。

不同TP 添加量對貯藏期間小龍蝦TBARS 值的影響見圖5。

圖5 不同TP 添加量對貯藏期間小龍蝦TBARS 值的影響Fig.5 Effects of different concentrations of tea polyphenols on TBARS value of crayfish during storage

由圖5 可知，隨貯藏時間的延長，TBARS 值逐漸增加，但經保鮮劑處理后的冷凍調理小龍蝦TBARS 值始終低于CK 組。這可能是由于不飽和脂肪酸產生的自由基被TP 提供的氫原子猝滅，自由基鏈式反應中斷，最終抑制MDA 生成[24]。TP 添加量為0.30 g/L 時，小龍蝦貯藏第15 天時MDA 含量最低。而添加量為0.1 g/L 時對氧化作用的抑制效果略低于0.15 g/L，為使響應面結果更加精準，選用0.15 g/L 作為TP 添加量的最低值。TP 添加量為0.3 g/L 雖具有最好的延緩脂質氧化效果，但由于其在食品中的最大添加量為0.3 g/L，因此，綜合食品安全和生產成本考慮，選擇TP 添加量0.15、0.20、0.25 g/L 進行響應面優化試驗。

不同RE 添加量對貯藏期間小龍蝦TBARS 值的影響見圖6。

圖6 不同添加量RE 對貯藏期間小龍蝦TBARS 值的影響Fig.6 Effects of different concentrations of rosemary extract on TBARS value of crayfish during storage

由圖6 可知，RE 能明顯減緩小龍蝦貯藏期間TBARS 值的增加。RE 添加量為0.10 g/L 時，TBARS含量高于添加量為0.15 g/L 處理組，可能是RE 添加量較低，且冷凍貯藏過程中氧化反應較慢。添加量為0.3 g/L 時，TBARS 值最低，這可能是由于RE 中含有的迷迭香酸、鼠尾草酸等酚酸類物質在較高添加量下加強了對脂質氧化的抑制作用。因而選擇迷迭香提取物添加量0.150、0.225、0.300 g/L 進行響應面優化試驗。

2.4 響應面法優化保鮮劑復配比

2.4.1 響應面試驗方案及結果

在單因素試驗的基礎上，選取PL 添加量、TP 添加量、RE 添加量為因素，以TBARS 值、TVB-N 值為響應值，進行三因素三水平的響應面優化試驗，測定結果如表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface design and results

2.4.2 響應面數學模型建立與顯著性檢驗

使用Design-Expert V8 統計分析軟件對表3 中的試驗結果進行線性二次多項式回歸擬合，得出TVB-N值（Y1）和TBARS 值（Y2）對PL（A）、RE（B）、TP（C）的二元多次回歸方程分別為Y1=5.22-0.188 8A-0.282 5B-0.134 9C-0.139 8AB+0.152 0AC+0.060 7BC+1.33A2+0.499 0B2-0.086 3C2；Y2=0.372 4-0.056 9A-0.035 0B-0.028 6C+0.035 0AB-0.021 8AC+0.027 0BC+0.274 9A2+0.122 2B2-0.001 6C2。

以TVB-N 值和TBARS 值為響應值的響應面數學模型結果見表4。

表4 模型和回歸系數顯著性檢驗Table 4 Model and regression coefficient significance test

由表4 可知，以TVB-N 值為響應值時，該模型與TVB-N 值間的線性關系極顯著，真實可靠（P＜0.000 1）。同時，TVB-N 模型失擬項F值為0.146 6，P值為0.926 7（P＞0.05），說明試驗數據無異常點，誤差較小。對TVBN 值模型的F值進行排序可知，各保鮮劑對冷凍調理小龍蝦貯藏過程中影響順序為RE（B）＞PL（A）＞TP（C）。以TBARS 值為響應值時，該模型與TBARS 值間的線性關系極顯著（P＜0.000 1）。同時，TBARS 模型失擬項F值為5.95，P值為0.058 8（P＞0.05），說明該數學模型試驗值與預測值有高度的相關性，可用于貯藏過程中冷凍調理小龍蝦TBARS 值變化的理論預測。由F值可知，各保鮮劑對冷凍調理小龍蝦貯藏過程中TBARS 值的影響順序為PL（A）＞TP（C）＞RE（B）。綜上可知，A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2對TVB-N 值的影響極顯著，表明PL 與RE、TP 之間交互作用顯著。A、B、C、A2、B2對TBARS 值的影響極顯著，AC、BC對TBARS 值影響顯著，表明PL 和TP、RE 和TP 在抑制TBARS 產生方面交互作用顯著。

2.4.3 響應面分析

3D 圖可直觀地反映復合保鮮劑對冷凍貯藏過程中小龍蝦TVB-N 值、TBARS 值的抑制效果。結合表4可知，以TVB-N 為響應值時PL 與RE、PL 與TP 交互作用顯著；以TBARS 為響應值時，PL 與TP、RE 與TP之間交互作用顯著。3 種生物保鮮劑添加量之間的具體交互作用見圖7。

圖7 因素交互作用圖Fig.7 Effects of factor interactions on the quality of crayfish during storage

經響應面分析得到，復合保鮮劑最佳添加量為PL0.207 g/L、RE0.237 g/L、TP0.205 g/L，此條件下貯藏15 d 后，冷凍調理小龍蝦TVB-N 值、TBARS 值分別為5.133 mg/100 g 和0.352 mg MDA/kg?？紤]實際操作，將試驗條件修正為聚賴氨酸鹽酸鹽添加量0.20 g/L、迷迭香提取物添加量0.23 g/L、茶多酚添加量0.20 g/L，此條件下進行3 次平行試驗，小龍蝦凍藏15 d 后測得TVB-N 值為（5.258±0.289）mg/100g，TBARS 值為（0.409±0.035）mg MDA/kg，與理論值無明顯差異，說明該模型真實可靠。

2.5 冷凍調理小龍蝦貯藏期間理化指標

在響應面試驗得出的最佳生物保鮮劑添加量下，對冷凍調理小龍蝦貯藏期間理化指標進行測定，結果見表5。

表5 驗證試驗Table 5 Validation tests

TVB-N 值是監測肉制品新鮮度和貨架期的重要指標之一，與內源酶活性和微生物生長呈正相關[25]，新鮮肉中TVB-N 值應小于20 mg/100 g，隨著新鮮度的下降，其值會逐漸增加。由表5 可知，經復合生物保鮮劑處理的小龍蝦貯藏60 d 后TVB-N 值增加至7.187 mg/100 g，較空白組低19%，表明復合生物保鮮劑減緩了蛋白質的降解速度。這種差異可能是由于復合生物保鮮劑對細菌種群和蛋白質的抑制作用[9]。冷凍調理小龍蝦貯藏60 d 后，空白組和生物保鮮劑組TBARS 值分別為0.669 mg MDA/kg 和0.602 mg MDA/kg。由于復合生物保鮮劑含有的酚酸、黃酮類物質可與氧化過程中產生的自由基、金屬離子進行結合，從而阻礙了MDA 的產生和積累。兩種處理方式下，菌落總數變化趨勢較為平緩，可能是由于熟制過程殺死部分微生物，凍藏環境使得微生物生長緩慢。小龍蝦貯藏60 d 后，生物保鮮劑處理組TBARS 值、TVB-N 值、菌落總數均低于空白組，表明復合生物保鮮劑可在一定程度抑制貯藏期間冷凍調理小龍蝦氧化反應和微生物活動，阻礙其腐敗變質。

3 結論

本研究通過體外抗氧化試驗和抑菌試驗篩選出PL、RE、TP 3 種具有良好抑菌抗氧化活性的生物保鮮劑，通過單因素試驗確定各保鮮劑最佳添加量范圍，利用響應面法確定復合生物保鮮劑的最佳添加量為聚賴氨酸鹽酸鹽添加量0.20 g/L、迷迭香提取物添加量0.23 g/L、茶多酚添加量0.20 g/L。對復合生物保鮮劑的作用效果進行測定，發現復合生物保鮮劑能在一定程度抑制小龍蝦貯藏過程的氧化反應和微生物生長，在改善食品品質的同時，彌補了實際生產過程中單一保鮮劑保鮮效力不足的現狀，對實際生產具有一定的指導意義。