反復(fù)呼吸道感染患兒外周血單個核細(xì)胞中TLR2、TLR4表達(dá)情況與Th1/Th2免疫應(yīng)答的關(guān)系*

趙淑景,馬志平,張金彪,付 峰,馮娜娜

滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院:1.兒科一區(qū);2.實驗診斷科;3.科教科,河北滄州 061000

反復(fù)呼吸道感染(RRTI)是兒科常見的呼吸系統(tǒng)疾病。RRTI患兒1年內(nèi)發(fā)生呼吸道感染的次數(shù)不在正常范圍內(nèi),包括上呼吸道和下呼吸道感染,而且兩次感染間隔時間7 d以上。該病病因并不完全清楚,主要與先天性因素、免疫功能低下及微量元素和維生素缺乏等有關(guān)[1]。目前最明確的病因之一是機體免疫功能異常。因幼兒免疫系統(tǒng)尚在發(fā)育階段,再加上呼吸系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)的特點,RRTI的疾病好發(fā)群體為年齡低于2歲的兒童[2]。如果RRTI患兒沒有得到及時的治療或正確的干預(yù),就有可能會并發(fā)心肌炎、哮喘等疾病,從而對身心健康和生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響[3]。RRTI的發(fā)生與機體免疫功能關(guān)系十分密切。輔助性T細(xì)胞(Th)在免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用,而Th的亞型Th1/Th2細(xì)胞因子水平可以反映出機體的免疫應(yīng)答是否處于平衡狀態(tài),與機體的炎癥反應(yīng)、抗腫瘤效應(yīng)等病理反應(yīng)有關(guān)[4]。Toll樣受體(TLRs)蛋白家族都屬于Ⅰ型跨膜蛋白,它可以通過對病原微生物的保守抗原分子進(jìn)行識別,從而對細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行激活,最終產(chǎn)生一系列炎癥細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)等,并激活機體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答,它是連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁[5]。有研究發(fā)現(xiàn),TLRs具有不同的表型及相應(yīng)配體,可使Th細(xì)胞朝不同方向分化,并能夠識別相關(guān)的細(xì)胞表面受體和參與Th型免疫應(yīng)答的調(diào)控[6]。目前,關(guān)于RRTI患兒外周血單個核細(xì)胞(PBMC)TLRs表達(dá)與Th免疫應(yīng)答關(guān)系的研究報道較少。因此,本研究擬通過對RRTI患兒PBMC中TLR2、TLR4的表達(dá)進(jìn)行檢測及與對照組進(jìn)行比較,旨在探討其與Th1/Th2免疫應(yīng)答的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年12月至2022年12月本院收治的65例確診為RRTI的患兒納入研究作為RRTI組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《反復(fù)呼吸道感染的臨床概念和處理原則》中兒童RRTI的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];(2)年齡2～6歲;(3)臨床資料完整;(4)病程1年以上。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)3個月內(nèi)接觸過射線;(2)合并血液類疾病、先天性疾病或家族有遺傳性疾病史;(3)3個月內(nèi)使用過影響免疫功能的藥物或激素類藥物;(4)有嚴(yán)重心、肝、腎等重要器官功能障礙;(5)在此研究前參加過其他研究;(6)在研究中途主動退出。另選取同期體檢的健康兒童45例作為對照組。RRTI組中,男31例、女34例,年齡2～6歲、平均(4.57±1.24)歲;對照組中,男20、女25例,年齡2～6歲、平均(5.04±1.04)歲。兩組兒童性別、年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。納入研究患兒的監(jiān)護(hù)人均對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本采集及處理 RRTI組于入院后次日(對照組于體檢當(dāng)日)清晨接受3 mL空腹靜脈血采集。將血液標(biāo)本置于無菌肝素抗凝管中,采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法,得到PBMC。

1.2.2指標(biāo)檢測 (1)實時熒光定量PCR(qPCR)檢測PBMC TLR2和TLR4信使核糖核酸(mRNA)相對表達(dá)水平。在得到PBMC后,用異硫氰酸胍(Trizol)法提取細(xì)胞總核糖核酸(RNA),反轉(zhuǎn)錄成互補脫氧核糖核酸(cDNA)后進(jìn)行qPCR檢測。(2)流式細(xì)胞儀檢測PBMC TLR2和TLR4蛋白表達(dá)率。將PBMC分裝在不同的反應(yīng)管中,分別孵育對應(yīng)抗體,其陰性對照為PE標(biāo)記的免疫球蛋白G(IgG),室溫避光染色0.5 h,加入溶血素,混勻后靜置1 min,離心15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次,最后上機檢測兒童PBMC TLR2和TLR4蛋白表達(dá)率。(3)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿中Th1細(xì)胞因子IFN-γ、Th2細(xì)胞因子IL-4水平及二者比值(IFN-γ/IL-4)。檢測使用IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒,操作步驟參考試劑盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1兩組兒童血漿IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較 RRTI組血漿Th2細(xì)胞因子IL-4水平高于對照組,血漿Th1細(xì)胞因子IFN-γ水平低于對照組,IFN-γ/IL-4低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組兒童血漿IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較

2.2兩組兒童PBMC中TLR2和TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)情況 RRTI組PBMC中TLR2和TLR4 mRNA相對表達(dá)水平及蛋白表達(dá)率均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組兒童PBMC中TLR2和TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)情況比較

2.3PBMC中TLR2、TLR4的蛋白表達(dá)率與血漿IFN-γ、IL-4水平的相關(guān)性分析 RRTI患兒PBMC中TLR2和TLR4的蛋白表達(dá)率與血漿IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與血漿IL-4水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 TLR2、TLR4的蛋白表達(dá)率與IFN-γ、IL-4的相關(guān)性分析

3 討 論

RRTI是指1年內(nèi)上呼吸道或下呼吸道感染次數(shù)頻繁,超過了一定范圍的呼吸道感染。不同的年齡RRTI診斷標(biāo)準(zhǔn)不同。反復(fù)上呼吸道感染,≤2歲嬰幼兒超過7次/年,3～5歲兒童為超過6次/年,≥6歲兒童為超過5次/年或反復(fù)下呼吸道感染,≤2歲嬰幼兒超過3次/年,3～5歲兒童超過2次/年,≥6歲兒童超過2次/年可診斷為RRTI[8]。RRTI的臨床表現(xiàn)有鼻塞、咳嗽等,還常常伴隨面色不佳、盜汗及呼吸困難等癥狀[9]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國兒童RRIT的發(fā)病率為20%左右[10],而且發(fā)病率呈逐年增加的趨勢,已經(jīng)成為了低齡兒童死亡的最重要原因之一。免疫、營養(yǎng)、感染及環(huán)境等都是導(dǎo)致RRTI發(fā)生的原因,其中免疫因素與RRTI有著密切的聯(lián)系[11]。如果不能得到及時的治療,患兒身心健康和生命安全會受到極大的損害。

IFN-γ屬于Th1的代表性細(xì)胞因子,能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化和成熟,引起巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表面抗原表達(dá),進(jìn)而參與抗原遞呈和特異性免疫識別過程[12]。IL-4屬于Th2的代表性細(xì)胞因子,可以刺激B細(xì)胞分泌IgE,抑制IFN-γ產(chǎn)生,引發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒,最后導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)釋放[13]。此外,Th1細(xì)胞因子IFN-γ對Th2細(xì)胞因子IL-4具有拮抗作用,能誘發(fā)IgE分泌,減少過敏反應(yīng)。因此,本研究分析了RRTI患兒血漿中Th1的代表性細(xì)胞因子和Th2的代表性細(xì)胞因子的水平。結(jié)果顯示,RRTI組血漿Th2的代表性細(xì)胞因子IL-4的水平明顯高于對照組,血漿Th1的代表性細(xì)胞因子IFN-γ的水平明顯低于對照組,IFN-γ/IL-4明顯低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明RRTI的發(fā)生、發(fā)展可能與患兒體內(nèi)Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡有關(guān)。Th1的主要細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)受到抑制,Th2的主要細(xì)胞因子IL-4過度活化。

TLRs不僅表達(dá)于免疫細(xì)胞的表面,如樹突狀細(xì)胞等,同時還在非免疫細(xì)胞表面表達(dá),如成纖維細(xì)胞等[14]。TLRs與機體炎癥和免疫反應(yīng)過程均有著緊密的聯(lián)系,而TLRs異常表達(dá)會導(dǎo)致炎癥和免疫反應(yīng)失衡,進(jìn)而誘發(fā)自身免疫性疾病[15]。人體中發(fā)揮重要作用的TLRs分子包括TLR2和TLR4分子。本研究利用qPCR和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法對RRTI患兒PBMC中TLRs分子的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果顯示,RRTI組PBMC中TLR2和TLR4 mRNA相對表達(dá)水平及蛋白表達(dá)率均明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明TLRs可以參與Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡的調(diào)節(jié),與李天萍等[16]的研究結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn),RRTI患兒PBMC中TLR2和TLR4蛋白表達(dá)率與血漿IFN-γ和IFN-γ/IL-4均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與IL-4均呈正相關(guān)(P<0.05)。這提示TLR2和TLR4可能通過TLR信號通路及配體參與Th1/Th2分化的調(diào)控,使Th2過度活化,從而大量釋放IL-4,減少IFN-γ的產(chǎn)生,最終引起Th1/Th2失衡,導(dǎo)致RRTI的發(fā)生。

綜上所述,RRTI患兒PBMC中TLR2、TLR4及血漿中的Th1/Th2細(xì)胞因子均可能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。RRTI患兒PBMC中TLR2和TLR4蛋白表達(dá)率的升高,可能會使Th1功能受損,Th2功能增強,導(dǎo)致Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡。