羅哌卡因對胃癌BGC-823細胞生物學行為及AMPK/Nrf2信號通路的影響*

袁風雷,張麗霞,李 民,李貴賓

1.華北醫療健康集團峰峰總醫院麻醉科,河北邯鄲 056000;2.華北醫療健康集團邯礦總醫院內科,河北邯鄲 056000;3.邯鄲市第一醫院麻醉科,河北邯鄲 056000;4.華北醫療健康集團峰峰總醫院普外科,河北邯鄲 056000

胃癌具有較高病死率,其發病率存在明顯的地區差異,治療方法有靶向藥物治療、手術切除、放療及化療[1]。癌細胞的復發和轉移是胃癌患者術后死亡的重要原因[2]。即便胃癌患者進行了腫瘤的完全切除,腫瘤組織中脫落的癌細胞也會進入血液循環系統,從而誘發腫瘤轉移和復發[3-4]。胃癌患者術后通常需要進行抗癌藥物治療,但抗癌藥物通常價格昂貴且有諸多不良反應,因此迫切需要開發新的經濟且高效的治療藥物。羅哌卡因可用于神經阻滯,能通過蛛網膜下腔注射、局部浸潤、靜脈給藥等多種方式發揮鎮痛作用[5]。此外,有研究表明羅哌卡因還可能對某些腫瘤細胞產生直接影響[6]。羅哌卡因可抑制人肝癌細胞的腫瘤生物學特性,使得癌細胞凋亡率增加[7]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相關因子2(Nrf2)信號通路在細胞能量穩態調節中起重要作用,與多種癌癥的發生、發展密切相關[8]。然而,目前關于羅哌卡因是否對胃癌細胞有影響及其作用機制尚不明確。本研究擬基于AMPK/Nrf2信號通路探討羅哌卡因對胃癌細胞生物學行為的影響,為胃癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料來源 胃癌BGC-823細胞(批號:W15985)購自宜昌易成生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 荷蘭Biostream BCI-40型CO2培養箱、美國PerkinElmer Victor X型酶標儀、美國BD Accuri C6型流式細胞儀、美國millipore PIRP12R48型Transwell小室均購自武漢貝蘭生物科技有限公司;澳大利亞Kewlab BM1650A型顯微鏡、美國ABI 7900型實時熒光定量PCR(qPCR)儀、美國UVP GDS-8000型凝膠成像系統均購自南京北魚生物科技有限公司。

1.2.2主要試劑 羅哌卡因(原料藥,純度>99.9%,批號Y29185)、順鉑(原料藥,純度≥99.75%,批號Y70164)均購自廣州楊葉生物科技有限公司;胎牛血清、RPMI1640培養基、基質膠、結晶紫染色液、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒、PCR試劑盒均購自岳陽嘉誠生物科技有限公司;細胞計數試劑-8(CCK-8)、Trizol試劑、反轉錄試劑盒、蛋白裂解液、BCA試劑盒、ECL試劑均購自湘潭嘉葉源生物科技有限公司;兔源AMPK、Nrf2、GAPDH一抗、羊抗兔二抗均購自深圳振強生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養、分組及干預 將胃癌BGC-823細胞置于含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI1640培養基,在5%CO2、37 ℃培養箱中靜置培養,每天更換培養液,在細胞覆蓋率達到70%左右時使用胰蛋白酶消化、傳代。選對數生長期的BGC-823細胞接種于96孔板上(5×104個/孔)進行實驗,實驗分組包括對照組、順鉑組及羅哌卡因低、中、高水平組。對照組:常規培養BGC-823細胞;順鉑組:BGC-823細胞培養基中含有5 mg/L的順鉑[9];羅哌卡因低、中、高水平組:BGC-823細胞培養基分別含有25、50、100 mg/L的羅哌卡因[10]。上述每組設6個平行樣本。

1.3.2CCK-8檢測BGC-823細胞存活率 將BGC-823細胞以5×104個/孔的密度接種于96孔板中,按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細胞后繼續培養48 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,3 h后,讀取450 nm波長處的吸光度(A)值,重復3次,通過A值計算BGC-823細胞的存活率。細胞存活率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.3.3Transwell小室實驗檢測BGC-823細胞侵襲能力 按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細胞,將基質膠溶解后添加到每個Transwell小室的上室中,37 ℃下固化3 h后,隨即添加1×105個BGC-823細胞到上室,并在下室中添加RPMI1640培養基(500 μL),孵育48 h,4%多聚甲醛固定,0.1%結晶紫染色,隨機選取5個視野使用顯微鏡捕獲細胞圖像,計算BGC-823細胞侵襲數量,數量越多代表細胞侵襲能力越強。

1.3.4流式細胞儀檢測BGC-823細胞凋亡率 按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細胞,培養48 h,將BGC-823細胞重懸,調整細胞密度為1×106個/mL,加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各15 μL,避光孵育20 min,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5BGC-823細胞中AMPK、Nrf2信使RNA(mRNA)水平的測定 按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細胞,培養48 h,使用Trizol試劑從BGC-8230細胞中提取總RNA,反轉錄合成cDNA,以此為模板,qPCR法檢測BGC-823細胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平,以U6為內參,引物由南通市銀琪生物科技有限公司設計合成。反應條件:93 ℃ 4 min,93 ℃ 26 s、44 ℃ 28 s、69 ℃ 31 s,共29個循環,74 ℃,4 min。根據PCR檢測試劑盒說明書配制反應體系。AMPK、Nrf2 mRNA水平的計算采用2-ΔΔCt法。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.6Western blot檢測BGC-823細胞中AMPK、Nrf2蛋白水平 按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細胞,培養48 h,使用蛋白裂解液裂解細胞,用BCA試劑盒對各組細胞的總蛋白水平進行定量檢測,用凝膠電泳分離各組等量蛋白質后轉膜,用脫脂牛奶配制的封閉液(質量體積百分比為5%)在室溫下封閉1 h,加入稀釋好的兔源AMPK(1∶660)、Nrf2(1∶750)、GAPDH(1∶900)一抗,4 ℃下孵育過夜。加入羊抗兔二抗(1∶1 500),室溫下孵育1 h,ECL試劑顯色,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內參,計算AMPK、Nrf2蛋白水平。

2 結 果

2.1各組BGC-823細胞存活率、侵襲數量的比較 與對照組比較,順鉑組、羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞存活率、侵襲數量均下降(P<0.05);與順鉑組比較,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞存活率、侵襲數量均增加(P<0.05);與羅哌卡因低水平組比較,羅哌卡因中、高水平組BGC-823細胞存活率、侵襲數目依次降低(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組BGC-823細胞侵襲圖(結晶紫染色,×200)

表2 各組BGC-823細胞存活率、侵襲數量的比較

2.2各組BGC-823細胞凋亡率比較 與對照組比較,順鉑組及羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞凋亡率均升高(P<0.05);與順鉑組比較,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞凋亡率均下降(P<0.05);與羅哌卡因低水平組相比,羅哌卡因中、高水平組BGC-823細胞凋亡率依次升高(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 流式細胞儀檢測各組BGC-823細胞凋亡

表3 各組BGC-823細胞凋亡率比較

2.3各組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較 與對照組比較,順鉑組、羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平均下降(P<0.05);與順鉑組比較,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平均升高(P<0.05);與羅哌卡因低水平組比較,羅哌卡因中、高水平組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平依次降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較

2.4各組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2蛋白水平比較 與對照組比較,順鉑組、羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2蛋白水平均降低(P<0.05);與順鉑組比較,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2蛋白水平均升高(P<0.05);與羅哌卡因低水平組比較,羅哌卡因中、高水平組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2蛋白水平依次降低(P<0.05)。見圖3、表5。

注:A為對照組;B為順鉑組;C為羅哌卡因低水平組;D為羅哌卡因中水平組;E為羅哌卡因高水平組。

表5 各組BGC-823細胞中AMPK、Nrf2蛋白水平比較

3 討 論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,隨著當前人們飲食質量及飲食習慣的改善,胃癌的整體發病率有所下降,胃癌的主要問題在于其預后差,患者生存率低,是全世界主要的公共衛生問題之一[11-12]。胃癌的轉移是患者預后較差的主要原因,探究胃癌轉移的發生機制對于開發出治療胃癌的新藥物意義重大。

羅哌卡因作為一種麻醉劑,廣泛應用于外科手術區域阻滯、硬膜外麻醉及分娩鎮痛[13-14]。目前關于羅哌卡因的抗癌作用已有報道,WANG等[15]的研究表明,羅哌卡因能通過調控整合素β1抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移。CHEN等[16]報道,羅哌卡因可通過阻滯細胞周期和誘導凋亡來抑制宮頸癌細胞生長。ZHAO等[17]發現,羅哌卡因能夠減弱乳腺癌細胞侵襲和遷移能力,使得癌細胞存活率降低,并誘導癌細胞凋亡,從而抑制乳腺癌進展。但是,目前關于羅哌卡因對胃癌BGC-823細胞生物學行為的影響尚不清楚。本研究使用羅哌卡因處理胃癌BGC-823細胞,結果發現,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細胞存活率、侵襲數量均明顯下降,凋亡率明顯升高,且羅哌卡因的水平越高效果越明顯,與WANG等[15]、CHEN等[16]、ZHAO等[17]研究結果一致。表明羅哌卡因能促進BGC-823細胞凋亡,抑制BGC-823細胞存活和侵襲,從而使得BGC-823細胞惡性生物學表現減少。

AMPK/Nrf2是與細胞生物學行為及氧化應激密切相關的信號通路,同時也可影響許多疾病的病理、生理進程[18-19]。AMPK可調節細胞能量穩態,抑制炎癥反應、氧化應激,Nrf2是AMPK的下游通路,AMPK的激活可促進下游分子Nrf2的細胞核轉位,上調Nrf2的表達[20-21]。研究發現,AMPK/Nrf2信號通路在多種癌癥中呈現異常激活。XIE等[22]報道,AMPK和Nrf2在骨肉瘤細胞中呈高表達,敲低AMPK和Nrf2可降低骨肉瘤細胞的存活率、遷移能力和增殖能力。WANG等[23]研究表明,抑制AMPK/Nrf2信號通路能夠增強黑色素瘤細胞的鐵死亡敏感性,抑制黑色素瘤細胞的增殖。本研究發現,羅哌卡因處理后的BGC-823細胞AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平明顯降低且呈現水平依賴性。結合XIE等[22]和WANG等[23]的研究,本課題組推測羅哌卡因對BGC-823細胞存活和侵襲的抑制作用及對BGC-823細胞凋亡的促進作用可能與抑制AMPK/Nrf2信號通路有關,羅哌卡因可降低AMPK/Nrf2信號通路活性,使得BGC-823細胞能量穩態破壞,從而改變BGC-823細胞生物學行為。

綜上所述,羅哌卡因能夠抑制BGC-823細胞存活和侵襲,促進BGC-823細胞凋亡,其機制可能與抑制AMPK/Nrf2信號通路有關。但本研究僅探討了羅哌卡因通過AMPK/Nrf2信號通路對胃癌BGC-823細胞存活、侵襲和凋亡的調控作用,羅哌卡因能否通過其他信號通路調控BGC-823細胞的生物學行為,有待進一步的探究。在下一步的研究中,本課題組將補充AMPK/Nrf2信號通路激活劑實驗進一步驗證本文的結論。