遵義市食源性沙門(mén)菌分子分型及耐藥研究*

韋德琴,朱 琳

貴州省遵義市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科,貴州遵義 563000

沙門(mén)菌廣泛存在于自然界,是全球食源性腹瀉病最常見(jiàn)的病原菌之一,可引起胃腸炎、類傷寒、敗血癥、局部化膿性感染等疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告,沙門(mén)菌造成的食物污染給世界各國(guó)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失,并且嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生命安全。由于沙門(mén)菌種類多達(dá)2 600多種型別[1],傳統(tǒng)分型鑒定技術(shù)需要實(shí)驗(yàn)室保存250多種不同的高質(zhì)量分型血清和350種不同的抗原[2],并且要求實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)豐富,技術(shù)水平高,除此之外該試驗(yàn)周期長(zhǎng)、精確度差,加大了社會(huì)各檢疫部門(mén)對(duì)食品中沙門(mén)菌的防治及監(jiān)控的難度。脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)是基于分子的快速分型方法,可提供更快、差異性更明顯和更準(zhǔn)確的沙門(mén)菌分型,克服了傳統(tǒng)血清分型的局限性,目前被認(rèn)為是細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”,已被公共衛(wèi)生部門(mén)和食品監(jiān)管機(jī)構(gòu)用于疫情調(diào)查和溯源分析。目前,抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用是臨床治療沙門(mén)菌病的主要措施,由于抗菌藥物的濫用出現(xiàn)了許多多重耐藥細(xì)菌、泛耐藥細(xì)菌以及全耐藥超級(jí)細(xì)菌,沙門(mén)菌作為重要的致病菌,其耐藥性不容忽視[3]。本研究對(duì)遵義市食品來(lái)源的21株沙門(mén)菌進(jìn)行血清分型、PFGE分子分型和藥敏試驗(yàn),為食源性沙門(mén)菌監(jiān)測(cè)與溯源提供理論依據(jù),同時(shí)為沙門(mén)菌感染病例合理使用抗菌藥物、規(guī)避引發(fā)耐藥提供幫助。

1 材料與方法

1.1一般材料 本試驗(yàn)分析的21株沙門(mén)菌均分離自遵義市2020-2022年紅花崗區(qū)、務(wù)川縣、鳳岡縣、余慶縣、道真縣、赤水市、綏陽(yáng)縣、桐梓縣、湄潭縣、仁懷市10個(gè)區(qū)縣食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目標(biāo)本。PFGE試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門(mén)菌H9812,取自貴州省疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌科。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株ATCC25922、ATCC27853均取自貴州省疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌科。

1.2儀器與試劑 沙門(mén)菌顯色平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、XLD瓊脂均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;沙門(mén)菌屬診斷血清購(gòu)自丹麥國(guó)家食品研究所;限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購(gòu)自 TaKaRa公司;蛋白酶K、Gelred染液購(gòu)自索萊寶公司;脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、顯影儀購(gòu)自Bio-Rad公司; CHNENF革蘭陰性菌藥敏板及配套試劑、Sensitire AIM自動(dòng)菌液加樣系統(tǒng)及分析系統(tǒng)均購(gòu)自賽默飛公司;質(zhì)譜儀鑒定儀購(gòu)自布魯克公司。

1.3方法 沙門(mén)菌血清型鑒定是根據(jù)White-Kauffmann Le Minor抗原表,利用玻片凝集法對(duì)21株沙門(mén)菌進(jìn)行O抗原和H抗原血清凝集試驗(yàn)確定菌株的血清型別。PFGE分子分型參照美國(guó)Pulse Net PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行,將21株分離的沙門(mén)菌株用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進(jìn)行PFGE,膠塊經(jīng)Gelred染液染色后成像。藥敏試驗(yàn)按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法檢測(cè)沙門(mén)菌對(duì)17種抗菌藥物(氯霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢噻肟、頭孢他啶、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素、阿米卡星、鏈霉素、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、多黏菌素、頭孢他啶/阿維巴坦、厄他培南、美羅培南、替加環(huán)素)的藥物敏感性,根據(jù)CLSI抗微生物藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100[4]的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)獲得敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結(jié)果,替加環(huán)素目前在M100標(biāo)準(zhǔn)里無(wú)R、S的判斷標(biāo)準(zhǔn),其R、S的判斷參考文獻(xiàn)[5]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用BioNumerics軟件進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建聚類樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1沙門(mén)菌血清分型 對(duì)21株沙門(mén)菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定,共鑒定出16種血清型,以C群(8株)、D群(5株)、E群(5株)為主,分別占38.10%、23.81%、23.81%,其中肯塔基沙門(mén)菌3株、德?tīng)柋吧抽T(mén)菌2株、腸炎沙門(mén)菌2株、希林登沙門(mén)菌2株,其余均為1株,見(jiàn)表1。

表1 21株食源性沙門(mén)菌血清型分布

2.2沙門(mén)菌PFGE分子分型 沙門(mén)菌用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ酶切后進(jìn)行PFGE試驗(yàn),結(jié)果顯示DNA片段得到較好的分離,可見(jiàn)大小不一的電泳條帶,見(jiàn)圖1。但菌株之間的相似性不高,同一血清型同源性也不高,其中2株肯塔基沙門(mén)菌同源性為62.96%,2株希林登沙門(mén)菌同源性為53.85%。

圖1 21株食源性沙門(mén)菌PFGE聚類分析圖譜

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示80.95%沙門(mén)菌對(duì)17種抗菌藥物存在不同程度的耐藥,見(jiàn)圖2。多重耐藥率達(dá)76.19%,其中1株吉韋沙門(mén)菌對(duì)10種抗菌藥物耐藥,1株希林登沙門(mén)菌對(duì)10種抗菌藥物耐藥,1株肯塔基沙門(mén)菌對(duì)11種抗菌藥物耐藥。多重耐藥情況見(jiàn)表2。21株沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高,為71.43%,其次是四環(huán)素(61.90%)、復(fù)方磺胺甲噁唑(61.90%)、鏈霉素(57.14%)、氯霉素(52.38%),對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦、厄他培南、美羅培南、替加環(huán)素敏感率均為100%,對(duì)頭孢噻肟和頭孢他啶也表現(xiàn)出了一定的耐藥性。

注:由于鏈霉素在體外可能表現(xiàn)為有活性,但臨床治療無(wú)效,目前M100標(biāo)準(zhǔn)里沒(méi)有規(guī)定鏈霉素敏感耐藥濃度,本文劃分為S≤4,R≥3。

表2 21株沙門(mén)菌耐藥譜

3 討 論

沙門(mén)菌被列為首選控制的食源性致病菌,其引起的食源性疾病是危害人類健康的重大隱患[6]。研究顯示,在世界范圍內(nèi)由沙門(mén)菌引起已確診的患病人數(shù)顯著增加,目前沙門(mén)菌每年導(dǎo)致歐洲有超過(guò)10萬(wàn)人患病,引起美國(guó)1 200萬(wàn)人感染、1.9萬(wàn)人住院甚至450人死亡[7],也是引發(fā)我國(guó)食物中毒的首要微生物。據(jù)資料統(tǒng)計(jì),在我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中,70%～80%是由沙門(mén)菌引起,而在引起沙門(mén)菌中毒的食品中,90%以上是肉類等動(dòng)物性產(chǎn)品。遵義市近年來(lái)在食品中頻繁檢出沙門(mén)菌,且檢出的沙門(mén)菌血清型復(fù)雜多樣,導(dǎo)致遵義市近年來(lái)頻繁發(fā)生一些由罕見(jiàn)血清型引起的腹瀉病例或者食物中毒事件。因此本研究初步研究了2020-2022年分離的21株食源性沙門(mén)菌的分型及藥敏試驗(yàn)結(jié)果,為社會(huì)防疫部門(mén)進(jìn)行防疫和食物中毒患者的治療提供理論依據(jù)。

沙門(mén)菌血清學(xué)分型種類繁多,達(dá)2 600多種血清型,在不同國(guó)家和地區(qū)的分布有差異性。在印度,鼠傷寒沙門(mén)菌、雞沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌是最流行的血清型,占分離株的96.2%[8];在埃及,腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌是最常見(jiàn)的血清型[9];在日本,肉雞樣本中僅存在嬰兒沙門(mén)菌、曼哈頓沙門(mén)菌和胥伐成格隆沙門(mén)菌[10];在我國(guó)福建省、濟(jì)南市、聊城市、成都市等地的腹瀉標(biāo)本中,鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌均為優(yōu)勢(shì)血清型[11-14],而國(guó)內(nèi)食源性疾病中沙門(mén)菌最常見(jiàn)的血清型是鼠傷寒、豬霍亂、都柏林、德?tīng)柋啊⒛c炎等沙門(mén)菌[15]。本研究中21株沙門(mén)菌來(lái)源于10個(gè)不同區(qū)縣,共鑒定為16種血清型,分布于B、C、D、E群,種類重復(fù)率低,無(wú)地區(qū)特異性。PFGE試驗(yàn)結(jié)果顯示,用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ酶切電泳后,DNA片段可得到了較好的分離,分離率達(dá)100%,但菌株之間的相似性不高,其中2株肯塔基沙門(mén)菌同源性為62.96%,2株希林登沙門(mén)菌同源性為53.85%。結(jié)果說(shuō)明沙門(mén)菌PFGE型別與血清型之間的關(guān)聯(lián)性并不明確,這與崔可琦等[16]報(bào)道的冰鮮雞生產(chǎn)鏈中同種血清型沙門(mén)菌可分布在多個(gè)PFGE譜型內(nèi)一致。以上結(jié)果提示遵義市食品中存在多種型別的沙門(mén)菌,食品中沙門(mén)菌污染源廣泛、復(fù)雜多樣,應(yīng)加大對(duì)沙門(mén)菌的防治及監(jiān)控力度。

雖然沙門(mén)菌病通常是一種自限性疾病[17],但該疾病可以全身性傳播并退化為慢性疾病,如反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、心臟炎癥或神經(jīng)疾病[18]。氨芐西林、氯霉素和甲氧芐啶-磺胺甲噁唑是臨床治療沙門(mén)菌病的主要藥物[3,19],但多年來(lái)由于抗菌藥物的不合理使用,使得沙門(mén)菌對(duì)抗菌藥物耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重[20],并且存在多重耐藥的問(wèn)題。本研究21株沙門(mén)菌耐藥率達(dá)80.95%,多重耐藥率達(dá)76.19%,對(duì)青霉素類耐藥率最高,對(duì)四環(huán)素和磺胺類抗菌藥物耐藥性強(qiáng)。這與我國(guó)沙門(mén)菌耐藥趨勢(shì)一致,現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)顯示其耐藥機(jī)制為相關(guān)耐藥基因tem、tet、sul分別通過(guò)編碼β-內(nèi)酰胺酶、外排泵和氫葉酸合成酶介導(dǎo)氨芐西林、四環(huán)素和磺胺類抗菌藥物耐藥。目前,臨床應(yīng)用頭孢菌素類抗菌藥物治療細(xì)菌性感染較為普遍,本研究中部分菌株對(duì)于頭孢他啶/頭孢噻肟耐藥現(xiàn)象不容忽視。針對(duì)頭孢他啶/頭孢噻肟的耐藥研究,21世紀(jì)初美國(guó)科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)攜帶bla頭孢菌素抗性基因的沙門(mén)菌在大洋洲、亞洲、非洲-中東和歐洲等地已經(jīng)出現(xiàn),其耐藥機(jī)制還不明確,可能與bla基因突變誘導(dǎo)外排泵的過(guò)表達(dá)、外膜蛋白表達(dá)減少以及導(dǎo)致外膜蛋白丟失的基因突變有關(guān)[21]。除此之外本研究中存在1株吉韋沙門(mén)菌對(duì)10種抗菌藥物耐藥,1株希林登沙門(mén)菌對(duì)10種抗菌藥物耐藥,1株肯塔基沙門(mén)菌對(duì)11種抗菌藥物耐藥,其廣泛的耐藥現(xiàn)象需要進(jìn)行深入研究。

本研究分析的沙門(mén)菌分離自2020-2022年食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目標(biāo)本,菌株量較低,還需增加菌株數(shù)才能得到更為準(zhǔn)確的結(jié)論,為沙門(mén)菌病患者用藥提供支持。但現(xiàn)有數(shù)據(jù)提示遵義市沙門(mén)菌污染源廣泛,耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,提示在各類食品生產(chǎn)和銷(xiāo)售中都需要保持警惕和嚴(yán)格監(jiān)管。