建立LC-MS/MS檢測血清中5種脂溶性維生素的方法及臨床驗證*

于 鵬,周傳貴,楚士穎,李 艷,2,遲 偉,田 晗,程文播,2△

1.天津國科醫(yī)療科技發(fā)展有限公司,天津 300399;2.中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所,江蘇蘇州 215163;3.遼寧省沈陽市婦幼保健院,遼寧沈陽 110014

脂溶性維生素是人體保持最佳新陳代謝狀態(tài)所必需的微量營養(yǎng)素,主要包括維生素A、維生素D、維生素E和維生素K 4種[1]。隨著研究的深入,脂溶性維生素的作用早已不局限于人們的初步認識,比如夜盲癥[維生素A(VA)缺乏]、骨軟化癥(維生素D缺乏)、氧化應激異常[維生素E(VE)缺乏]和異常出血(維生素K缺乏)等,而是發(fā)現(xiàn)脂溶性維生素的異常變化與越來越多的疾病及其他生理狀態(tài)有關[2]。有研究表明VA可促進免疫系統(tǒng)發(fā)育[3],增強免疫能力[4],其含量低甚至與成人早期肥胖有關[5];維生素D在某些精神性疾病和糖尿病的預防方面有一定作用[6-7];適宜濃度的VE對癌癥預防和糖尿病腎病、非酒精性脂肪肝的治療有所幫助[8-9];維生素K則與兒童的矮小癥和成人的冠心病有一定關聯(lián)[10-11]。因此,建立一種快速、準確的臨床檢測多種脂溶性維生素的方法愈發(fā)重要,這將大大加快人們研究以及運用各種脂溶性維生素的進程。

近年來,國內(nèi)外液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術正在快速發(fā)展。放射免疫法和酶聯(lián)免疫法等傳統(tǒng)檢測方法[12-13]存在放射污染的潛在風險及易與其他非目標化合物發(fā)生交叉反應而導致特異性差等缺點。LC-MS/MS具有高特異度、高靈敏度、高準確性等優(yōu)勢,使之在檢測領域的各個方面被快速推廣[14],特別是在維生素檢測方面[15],LC-MS/MS可以同時檢測25-羥基維生素D2(25-OH-D2)和25-羥基維生素D3(25-OH-D3)的精確濃度,使之成為國際上公認的維生素D檢測的金標準[16]。當然,該方法也面臨所需樣品量大、前處理復雜耗時且儀器操作較為復雜等問題。為了進一步拓展LC-MS/MS在檢測維生素方面的應用,大量學者開展了相關研究,例如陳敏純等[17]開發(fā)了僅需200 μL血清樣品即可檢測4種脂溶性維生素的方法。本研究則將針對VA、維生素D(25-OH-D2、25-OH-D3)、VE和維生素K1(VK1)5種脂溶性維生素建立LC-MS/MS的檢測方法,實現(xiàn)利用更少的樣品(100 μL血清),進行簡單的前處理過程,使用同位素標記法在短時間內(nèi)同時對5種脂溶性維生素實現(xiàn)精準定量,并對臨床血清樣品進行驗證,為臨床醫(yī)生的準確判斷提供真實、可靠的體內(nèi)脂溶性維生素水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所選儀器:天津國科醫(yī)療科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的HTQ 2020高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng),德國Eppendorf公司生產(chǎn)的高速冷凍離心機,杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)的氮吹儀;所選試劑:購于美國Sigma-Aldrich公司的VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE,購于上海甄準生物科技有限公司的VA-d4、25-OH-D2-d6、25-OH-D3-d6、VE-d6,購于上海譜芬生物科技有限公司的VK1、VK1-d7,甲酸、甲醇、正己烷、乙腈等均為色譜級試劑;所選樣品為2021年10月至2022年6月在沈陽市婦幼保健院健康查體的19例隨機健康人血清。

1.2樣品前處理 取100 μL標準溶液或樣品,為消除人體血清中的不同內(nèi)源性物質(zhì)對維生素檢測的基質(zhì)效應,加入10 μL同位素內(nèi)標工作液,加入200 μL甲醇/乙腈混合溶液渦旋混勻2 min,加入600 μL正己烷,渦旋混勻2 min,4 000 r/min離心5 min,取500 μL上清液,室溫氮氣吹干,加入乙腈水溶液復溶后上機測試。

1.3液相色譜條件 采用Phenomenex Kinetex C18(50.0 mm×3.0 mm,2.6 μm)色譜柱,柱溫設置為40 ℃,流動相A相為0.1%甲酸水溶液,流動相B相為0.1%甲酸甲醇溶液,洗脫程序見表 1,流速為0.6 mL/min,進樣體積為20 μL。

表1 梯度洗脫時間程序

1.4質(zhì)譜條件 采用多反應監(jiān)測(MRM)、大氣壓化學電離正離子模式(APCI+),離子源溫度300 ℃,氣簾氣壓10 psi,噴霧氣壓50 psi,加熱氣壓10 psi,碰撞氣壓9 psi;5種脂溶性維生素的MRM離子參數(shù)見表2。

表2 5種脂溶性維生素及其內(nèi)標的MRM離子參數(shù)

1.5定量下限 根據(jù)脂溶性維生素的臨床檢測需求及儀器設備的靈敏度,設置本方法的定量下限:VA為50 ng/mL、25-OH-D2為2 ng/mL、25-OH-D3為2 ng/mL、VE為1 000 ng/mL、VK1為0.5 ng/mL,連續(xù)檢測12次,計算檢測值和理論值的偏差以及測試結(jié)果的相對標準偏差(RSD)。

1.6精密度、加標回收率和攜帶污染測定 (1)按1.2樣品前處理方法在含5%BSA標本中添加不同濃度的標準溶液作為質(zhì)控樣品(低濃度質(zhì)控QCL、中濃度質(zhì)控QCM、高濃度質(zhì)控QCH),每個濃度質(zhì)控樣品重復制備3份,按上述分析條件對質(zhì)控樣品進行每天3次檢測,連續(xù)檢測3 d,以衡量其日內(nèi)精密度和日間精密度。(2)在收集的健康人血清樣品中添加不同濃度的標準溶液(QCL、QCM、QCH)獲得不同濃度的加標樣品,按1.2樣品前處理方法對健康人血清樣品和加標樣品進行處理,每個濃度樣品重復制備6份,按上述的檢測方法對各加標回收樣品進行分析,利用各標準品的校準曲線計算不同樣品濃度,各濃度質(zhì)控樣品與實際血清樣品的檢測值差值與實際添加的標準品濃度的比值作為加標回收率。(3)對該方法的攜帶污染進行評估,先重復進樣低濃度標本,然后交替進樣高濃度標本和低濃度標本。通過比較第1次進樣的低濃度標本檢測結(jié)果與隨后進樣的低濃度標本檢驗結(jié)果的差異,得到攜帶污染率。

2 結(jié) 果

2.1定量下限標本測試結(jié)果 VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE、VK1測試值和理論值的偏差均在15%以內(nèi),測試的平行標本RSD在15%以內(nèi)。見表3。

表3 定量下限標本測試結(jié)果(n=12)

2.2MRM色譜圖與線性測試結(jié)果 經(jīng)上述1.2樣品前處理后,在上述色譜條件及質(zhì)譜條件下獲得5種脂溶性維生素及其內(nèi)標的MRM色譜圖,見圖1。

圖1 5種脂溶性維生素標準溶液及其相對應的內(nèi)標MRM色譜圖

根據(jù)VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE、VK1的臨床檢測需求確定檢測范圍,并在檢測范圍需求內(nèi)設置濃度梯度,檢測梯度濃度的標準品,將目標分析物和內(nèi)標峰面積的比值與梯度濃度進行擬合,得到工作曲線,擬合曲線及曲線方程如圖 2所示。由圖可知標準曲線呈良好的線性關系,且r值均在0.998以上,因此該檢測方法的線性范圍分別是VA為50～2 000 ng/mL、25-OH-D2為2～150 ng/mL、25-OH-D3為2～250 ng/mL、VE為1 000～16 000 ng/mL、VK1為0.5～20 ng/mL。

2.3精密度測定結(jié)果 日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果如表4所示,日內(nèi)精密度在1.87%～8.50%,日間精密度在2.85%～9.81%。

表4 脂溶性維生素低、中、高濃度樣品日內(nèi)精密度和日間精密度考察結(jié)果(n=3)

2.4加標回收率測定結(jié)果 加標回收率測定結(jié)果如表5所示,結(jié)果顯示在91.47%～107.30%。

表5 脂溶性維生素低、中、高濃度樣品加標回收率考察結(jié)果(n=6)

2.5攜帶污染 各脂溶性維生素攜帶污染率如下:VA為1.32%,25-OH-D2為-0.05%,25-OH-D3為-6.03%,VE為-3.93%,VK1為2.14%。

2.6血清樣品檢測 使用本方法對19例健康者血清樣品進行處理檢測,檢測結(jié)果如下:VA為250.00～730.00 ng/mL,25-OH-D2為0.46～5.82 ng/mL,25-OH-D3為3.97～42.47 ng/mL,VE為2 200.00～13 100.00 ng/mL,VK1為0.13～1.51 ng/mL。空白樣品的MRM色譜圖如圖3所示,人血清樣品的MRM色譜圖如圖4所示。

圖3 空白樣品中5種脂溶性維生素及其相對應的內(nèi)標MRM色譜圖

3 討 論

不同脂溶性維生素在不同人群體內(nèi)的含量差別十分明顯,其作用也各不相同,而且往往是多種維生素共同起作用而產(chǎn)生影響。有研究證明孕婦這一特殊群體更易出現(xiàn)25-OH-D2、25-OH-D3缺乏的現(xiàn)象[18],而缺乏VA和VE的新生兒更易發(fā)生低體質(zhì)量和免疫力低下等問題[19],另外骨質(zhì)疏松癥的患者更可能存在維生素D和維生素K缺乏的現(xiàn)象[20]。然而,傳統(tǒng)的檢測方式難以同時實現(xiàn)對多種脂溶性維生素的準確定量檢測。LC-MS/MS可以在較寬的檢測范圍內(nèi)快速、準確地獲得未知樣品中待測物質(zhì)的濃度,具有更高的特異度和準確度,可以為臨床檢測提供更為可靠的參考結(jié)論,從而更快速地為患者制訂治療方案。但該技術需要的樣本量相對較多,操作具有一定的復雜性,使之難以在普通醫(yī)院推廣[21]。因此本研究進一步簡化其操作流程,減少樣品用量,規(guī)范整個檢測過程,醫(yī)護人員僅需簡單培訓即可掌握該操作,在幾分鐘內(nèi)完成整個檢測過程。

另外,本研究針對血清中VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE和VK1建立的LC-MS/MS方法檢測結(jié)果顯示,各種脂溶性維生素在標準曲線濃度范圍內(nèi)線性程度良好,日內(nèi)精密度和日間精密度較為理想,利用新鮮血清進行加標檢測證明加標回收率良好,在檢測高濃度及其以下濃度標本時不存在明顯的攜帶污染,可滿足臨床檢測要求。而且,針對真實健康者血清樣品的檢測結(jié)果顯示,各種脂溶性維生素水平符合當?shù)厝巳旱奶攸c[22],證實本研究所建立的方法切實適合臨床檢測。

綜上所述,本研究成功建立了一種針對人血清中5種脂溶性維生素快速定量的LC-MS/MS方法,不僅操作簡單,而且定量準確,適合臨床血清樣品的檢測,可以為臨床醫(yī)生的醫(yī)學診斷提供真實、可靠的體內(nèi)脂溶性維生素水平,幫助不同人群進行健康水平判斷和相關疾病治療。