渤海黑牛與荷斯坦奶牛瘤胃微生物群落組成及功能比較研究

董沛雨，閆陳雨湄，楊占崗，張淑二，張西鋒*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；2.山東無棣華興渤海黑牛種業(yè)股份有限公司，山東濱州 25190；3.山東省畜牧總站，山東濟南 250022）

荷斯坦奶牛主要棲息于廣袤的草地和湖泊，生活于氣候溫和、雨量充沛的地勢較濕的地方，在中國主要分布于黑龍江、內(nèi)蒙古、河北、新疆、山東等北方地區(qū)，對飼料的質(zhì)量和種類要求較高，需要提供營養(yǎng)均衡、適口性好的飼料，以滿足其生長發(fā)育和產(chǎn)奶的需求，繁殖力較低，極少產(chǎn)雙胎[1]。

渤海黑牛是一種具有獨特特點和優(yōu)勢的牛品種，其經(jīng)濟價值也非常高。渤海黑牛具有耐粗飼、適應(yīng)性強、產(chǎn)肉和役用能力較好等品種優(yōu)勢，這些優(yōu)勢使得渤海黑牛能夠在各種環(huán)境下生存和繁殖，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供穩(wěn)定且高質(zhì)量的役用和肉用資源。渤海黑牛的肉質(zhì)細(xì)嫩，呈大理石狀，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛[2]。因此，在市場上具有較高的競爭力，能夠帶來較高的經(jīng)濟效益。

瘤胃微生物是牛體內(nèi)的重要組成部分，在牛的瘤胃中，存在著大量的微生物，包括有益菌和有害菌，這些微生物與牛的健康和養(yǎng)殖效益密切相關(guān)[3]。瘤胃微生物對牛的營養(yǎng)吸收和消化有著重要作用。牛的瘤胃中的微生物幫助分解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等粗纖維，為牛提供營養(yǎng)[4]。同時，這些微生物還參與分解牛代謝過程中產(chǎn)生的毒素，保持牛機體健康。瘤胃微生物群落的平衡與牛的免疫力密切相關(guān)，當(dāng)瘤胃微生物群落失衡時，可能會導(dǎo)致腹瀉、感染等問題，影響牛的健康和生長[5]。本研究通過16S rDNA 測序的生物信息學(xué)分析渤海黑牛與荷斯坦奶牛瘤胃微生物組成的異同，挖掘渤海黑牛瘤胃菌群的典型特征。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究中使用的數(shù)據(jù)集來自于國家生物技術(shù)信息中心（NCBI），BioProject：PRJNA489133。

1.2 16S rDNA 生物信息學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 瘤胃菌群的群落組成

在門水平上，渤海黑牛的優(yōu)勢菌為Bacteroidota 和Firmicutes，荷斯坦奶牛的優(yōu)勢菌為Bacteroidota，F(xiàn)irmicutes，Proteobacteria（圖1A）。在科水平上，渤海黑牛的Oscillospiraceae，Rikenellaceae，Ruminococcaceae，Christensenellaceae更加豐富，而荷斯坦奶牛具有高豐富度的Succinivibrionaceae（圖1B）。在屬水平上，渤海黑牛的 Christensenellaceae_R_7_group，NK4A214_group，Rikenellaceae_RC9_gut_group，Ruminococcus 更加豐富，值得注意的是渤海黑牛中未檢測到Succinivibrionaceae_UCG_001（圖1C）。Rarefaction curve 分析表明渤海黑牛物種的豐富程度更高（圖1D）。

圖1 渤海黑牛和荷斯坦奶牛瘤胃微生物群的群落組成

2.2 渤海黑牛和荷斯坦奶牛瘤胃菌群α 多樣性和β 多樣性

Chao1，Observed 和ACE 指數(shù)表明渤海黑牛瘤胃群落物種更豐富（圖2A，D，E），Shannon和Simpson 指數(shù)表明渤海黑牛群落多樣性更高（圖2B，C），基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，渤海黑牛和荷斯坦奶牛細(xì)菌群落的β 多樣性存在差異（圖2F）。

圖2 渤海黑牛和荷斯坦奶牛菌群α 多樣和β 指數(shù)

2.3 瘤胃菌群相關(guān)性

Spearman 等級相關(guān)性（P ＜0.05，R＞0.6）分析渤海黑牛和荷斯坦奶牛科水平上瘤胃微生物之間的相互作用關(guān)系，筆者發(fā)現(xiàn)Succinivibrionaceae，Spirochaetaceae，Veillonellaceae，Gastranaerophilales 在荷斯坦奶牛瘤胃中起重要調(diào)控作用，渤海黑牛有著更復(fù)雜的瘤胃微生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn) Methanobacteriaceae，Christensenellaceae，Oscillospiraceae，Erysipelatoclostridiaceae，Marinilabiliaceae，Anaerolineaceae 均是重要的調(diào)控瘤胃環(huán)境穩(wěn)定的微生物（圖3A，B）。

圖3 渤海黑牛和荷斯坦奶牛瘤胃微生物網(wǎng)絡(luò)的交互關(guān)系

2.4 瘤胃標(biāo)志微生物

機器學(xué)習(xí)方法識別重要特征或潛在生物標(biāo)志物，線性判別分析效應(yīng)大小（LEfSe）和隨機森林分析展示了渤海黑牛和荷斯坦奶牛屬水平上前15 的標(biāo)志微生物（圖4A，B）。使用聚類熱圖將共同識別的標(biāo)志性物種展示豐度表達(dá)。發(fā)現(xiàn)SP3_e08，Papillibacter，Christensenellaceae_R_7_group，Ruminococcus 是渤海黑牛瘤胃標(biāo)志微生物（圖4C）。

圖4 渤海黑牛和荷斯坦奶牛瘤胃關(guān)鍵差異標(biāo)志微生物及分布

2.5 瘤胃菌群的功能預(yù)測

使用PICRUSt 進一步對16S 測序數(shù)據(jù)進行挖掘，預(yù)測菌群基因可能攜帶的功能，KO 數(shù)據(jù)庫對菌群的基因功能注釋結(jié)果，再使用STAMP 對菌群基因功能進行差異分析（圖5）。渤海黑牛瘤胃微生物可能有著更高的碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism），氨基酸代謝（Amino acid metabolism），能量代謝（Energy metabolism）水平。荷斯坦奶牛瘤胃微生物在核苷酸代謝（Nucleotide metabolism），脂質(zhì)代謝（Lipid metabolism），聚糖生物合成和代謝（Glycan biosynthesis and metabolism），輔因子和維生素的代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）水平更高。

圖5 渤海黑牛和荷斯坦奶牛瘤胃微生物群的功能預(yù)測和差異代謝通路

3 討論

渤海黑牛具有耐粗飼的優(yōu)點，能夠適應(yīng)不同種類的飼料，對于粗飼料的消化吸收能力較強，而荷斯坦奶牛對于飼料的質(zhì)量和種類要求較高，需要提供營養(yǎng)均衡、適口性好的飼料。渤海黑牛具有適應(yīng)性強、耐寒、耐熱的優(yōu)點，能夠適應(yīng)不同的氣候條件和環(huán)境，而荷斯坦奶牛對于環(huán)境的要求較高，需要保持圈舍清潔、干燥、通風(fēng)良好。渤海黑牛的肉質(zhì)口感好、役用能力較好，而荷斯坦奶牛則以產(chǎn)奶量高而著稱，主要用于奶制品生產(chǎn)。

瘤胃微生物的α 多樣性和β 多樣性對牛的生理功能和健康狀況具有重要影響[7]。瘤胃微生物的α 多樣性是指瘤胃中物種豐富度和均勻度的變化，α 多樣性較高的瘤胃微生物群落能夠提高牛對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，從而提高其生產(chǎn)性能，豐富度高的瘤胃微生物群落能夠更全面地分解飼料中的纖維，產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等，這些短鏈脂肪酸是牛獲取能量的主要來源之一。同時，短鏈脂肪酸還可以調(diào)控瘤胃pH 值，維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，有利于牛的健康。瘤胃微生物的β 多樣性也稱為群落結(jié)構(gòu)多樣性，是指不同物種在群落中的相對豐度。β 多樣性較高的瘤胃微生物群落則意味著不同物種在群落中占據(jù)平衡，這有助于提升群落的適應(yīng)性和穩(wěn)定性，因此，維持一定程度的β 多樣性對于牛的生理功能和健康狀況至關(guān)重要。在本研究中渤海黑牛有著更高的α 多樣性，且與荷斯坦奶牛相比β 多樣性有著顯著差異，所以渤海黑牛有著更健康的瘤胃狀態(tài)，豐富的微生物群落能夠抑制有害菌的生長。

在科水平上，Oscillospiraceae 和 Christensenellaceae 在渤海黑牛中具有高豐富度，并且在瘤胃微生物調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中也占據(jù)核心地位。同時，Succinivibrionaceae 在荷斯坦奶牛中占據(jù)重要比例。Oscillospiraceae 是瘤胃微生物群落的重要組成部分，參與了瘤胃中的發(fā)酵過程，將植物纖維分解為更小的碎片，并產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸等有機物質(zhì)，為牛提供能量。此外，Oscillospiraceae還具有調(diào)節(jié)瘤胃微生物群落的作用，與其他微生物相互作用，共同維持瘤胃微生物群落的平衡和穩(wěn)定[8]。Christensenellaceae 在瘤胃中的作用主要是參與分解纖維素等粗纖維，為牛提供營養(yǎng)[9]。瘤胃是反芻動物的重要消化器官，其中的微生物群落幫助動物分解纖維素等難以消化的物質(zhì)。Succinivibrionaceae 中的一些成員可以產(chǎn)生琥珀酸，這是一種重要的中間代謝產(chǎn)物，可以參與碳水化合物的代謝過程[10]。此外，Succinivibrionaceae 的一些菌種具有益生作用，可以促進瘤胃健康，減少瘤胃疾病的發(fā)生。使用機器學(xué)習(xí)算法分析物種的重要性時，我們發(fā)現(xiàn)Papillibacter 和Ruminococcus 是渤海黑牛的標(biāo)志微生物屬。Papillibacter 能夠促進瘤胃微生物的發(fā)酵，增加揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)乙酸和丙酸的比例，促進纖維素的消化和降解，并調(diào)節(jié)瘤胃pH 值。Ruminococcus 對反芻動物有多種益處，包括提供更多的能量來源、調(diào)節(jié)瘤胃環(huán)境、促進微生物生長和發(fā)酵、平衡能量代謝等[11]。總的來說，這些微生物在反芻動物的能量代謝、生長性能和健康狀況方面具有重要意義。

通過對瘤胃微生物功能預(yù)測分析，筆者認(rèn)為渤海黑牛的瘤胃微生物可能具有更高的碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝水平，這可能使其具有更高的能量代謝效率和更好的蛋白質(zhì)合成能力，有助于渤海黑牛在生長速度、飼料轉(zhuǎn)化率和肌肉發(fā)育方面發(fā)揮優(yōu)勢。而荷斯坦奶牛的瘤胃微生物在核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、聚糖生物合成和代謝以及輔因子和維生素的代謝方面具有更高的水平。這些代謝過程可能與荷斯坦奶牛的乳脂合成、免疫應(yīng)答和繁殖性能有關(guān)。因此，荷斯坦奶牛可能在乳脂含量、免疫力和繁殖性能方面具有優(yōu)勢。

不同飼料對牛瘤胃微生物組成和多樣性的影響主要體現(xiàn)在飼料類型、營養(yǎng)成分和纖維含量等方面[12]。粗飼料如干草、秸稈等富含纖維素，而精飼料如玉米、豆粕等則含有較高的糖類和蛋白質(zhì)，這些飼料成分的不同會對瘤胃微生物的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響。例如，纖維素分解菌在以粗飼料為主的牛瘤胃中較為豐富，而糖類發(fā)酵菌在以精飼料為主的牛瘤胃中較為活躍。環(huán)境因素如溫度、濕度和季節(jié)等也會影響瘤胃微生物的多樣性。例如，在高溫環(huán)境下，動物需要通過增加飲水和排泄來散熱，這可能會導(dǎo)致瘤胃pH 值的改變，進而影響瘤胃微生物的多樣性。濕度和季節(jié)的變化也可能會影響瘤胃微生物的定植和生長，從而影響動物健康和生產(chǎn)性能。綜上所述，飼料種類、飼養(yǎng)環(huán)境、管理方式等因素也可能對牛瘤胃內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此，渤海黑牛瘤胃內(nèi)沒有Succinivibrionaceae_UCG-001 可能是由多種因素綜合作用的結(jié)果。通過深入研究不同飼料和環(huán)境因素對牛瘤胃微生物的影響，可以為優(yōu)化飼養(yǎng)策略、提高動物生產(chǎn)性能和健康狀況提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

瘤胃微生物在反芻動物的營養(yǎng)吸收、生長性能和健康狀況方面具有重要作用，因此對瘤胃微生物的研究對于提高動物的養(yǎng)殖效益和人類健康具有重要意義。本研究通過比較渤海黑牛和荷斯坦奶牛的瘤胃微生物組成，揭示了兩種牛的瘤胃微生物群落在科水平上的差異和各自的優(yōu)勢，這些發(fā)現(xiàn)有助于更好地理解不同品種牛的生理特點和優(yōu)勢，為牛的育種和飼養(yǎng)提供參考。