基因編輯技術在豬育種中的研究進展

劉志國，黃 雷，楊麗景，王 楠,2，牟玉蓮*

（1.中國農業科學北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2.中國農業科學院農業基因組研究所，廣東深圳 518120；3.天津市寧河原種豬場有限責任公司，天津 301504）

我國是世界上最大的豬肉生產和消費國，生豬育種和養殖是關系著我國國計民生的大產業，在農業生產和國民經濟中占有重要地位，對國民生活水平及肉類供應安全至關重要。傳統表型選擇育種技術為我國的生豬品種改良做出了重大貢獻，但是表型選擇育種技術不僅受到種群內現有遺傳變異的限制，同時在改良復雜性狀尤其是低遺傳力性狀方面存在先天不足，且在育種周期、育種成本、選種準確性等方面都還需要進一步提升。新型遺傳工程技術，特別是以基因編輯技術為代表的高效、精準基因工程技術的出現，為生豬育種提供了前所未有的新工具和新方法。通過CRISPR/Cas9 等基因編輯技術，可以直接對豬基因組進行精確修改，從而對豬的單個或者多個目標性狀實現持續性改良，為生豬種質創新和新品種培育提供了革命性的技術手段，是我國養豬業可持續發展和肉類供應安全的保障。本文對基因編輯技術及其在豬遺傳育種方面的研究和應用情況進行介紹，以期為相關科研人員、育種工作者以及政策制定者提供參考。

1 基因編輯技術研究進展

1.1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術

CRISPR/Cas9 系統的全稱為規律成簇間隔短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）以及CRISPR相關蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）。該系統是在細菌和古細菌中廣泛存在的一種獲得性免疫系統[1]，細菌和古細菌通過該系統特異性的抵抗外源基因導入。2013 年，Jennifer 等[2]首次報道了CRISPR/Cas9 系統可改造為可編程的RNA 引導的DNA 核酸內切酶。Cong 等[3]和Mali等[4]利用改造后的CRISPR/Cas9 系統首次在哺乳動物細胞中實現了靶向基因編輯。此后，CRISPR/Cas9 技術因其簡單、高效的特點迅速成為植物、動物、微生物基因敲除、基因敲入、大片段刪除等遺傳操作的首選技術。

CRISPR/Cas9 基因編輯系統由一條單鏈向導RNA（single guide RNA，sgRNA）和Cas9 蛋白構成，sgRNA 能夠與Cas9 蛋白結合并改變其構象，并通過堿基互補配對與靶向DNA 特異性結合。Cas9 蛋白是一種脫氧核糖核酸內切酶，能夠在sgRNA 的引導下切割DNA 雙鏈，導致DNA雙鏈斷裂（Double strand break，DSB，圖1），激活細胞自身DNA 損傷修復機制。DSB 的修復方式主要分為非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組修復（Homology-directed repair，HDR）兩種類型。大多數情況下，細胞優先啟動NHEJ 機制，直接將斷裂的DNA 兩端連接起來。這種修復方式容易使斷裂部位發生堿基對隨機的插入或缺失，如果這種隨機插入或缺失發生在基因編碼區且插入或者缺失的堿基對數量不是3 的倍數時，就會產生移碼突變進而導致基因功能喪失[3]。如果存在與DSB 區域序列相同的同源序列，則細胞會有一定的概率激活HDR 機制，根據同源片段序列信息對DSB 區域進行精準修復。利用細胞的HDR 機制，向細胞導入具有同源序列的單鏈或者雙鏈DNA 片段（供體DNA），即可將供體DNA 中的遺傳信息精準復制到細胞基因組DNA 中，實現目的基因敲入[3]。

圖1 CRISPR/Cas9 系統介導基因編輯的工作原理[3]

1.2 單堿基編輯技術

單堿基編輯器（Base editors，BE）是在CRISPR/Cas9 系統上進一步發展出的一種不依賴于DSB 的新型基因編輯技術，根據堿基轉換類型可分為腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editors，ABE）、胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine base editors，CBE）等多種類型。David 等[4]率先開發出CBE（圖2）堿基編輯器系統。CBE系統主要由無核酸切割活性的Cas9（deactivated Cas9，dCas9）蛋白或者單鏈切割活性的Cas9（Nickase Cas9，nCas9）蛋白，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（Uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI），胞嘧啶脫氨酶以及連接肽等元件融合組成，其工作原理是dCas9-胞嘧啶脫氨酶復合物或者nCas9-胞嘧啶脫氨-UGI復合物在sgRNA 引導下特異性與目標DNA 序列結合，dCas9 或者nCas9 蛋白使DNA局部解鏈，胞嘧啶脫氨酶與非sgRNA 互補配對的DNA 鏈結合，將該鏈上特定區域的胞嘧啶（C）脫氨變成尿嘧啶（U），而尿嘧啶（U）則可以通過細胞自身的DNA 修復或DNA 復制機制被胸腺嘧啶（T）替換，最終實現完成C 到T 以及互補鏈G 到A 的替換。UGI 的作用是抑制哺乳動物細胞內的尿嘧啶DNA 糖基化酶活性，防止其識別U-G 錯配并通過堿基錯配修復途徑將U-G 逆轉為原始C-G 堿基對，從而提高哺乳動物細胞內的C到T 轉換效率[5]。

圖2 CBE 系統的工作原理[4]

2017 年，David 等[6]進一步開發出ABE 堿基編輯系統（圖3）。與CBE 堿基編輯系統類似，ABE 堿基編輯主要由腺嘌呤脫氨酶與nCas9 蛋白融合組成。但是與CBE 系統不同的是，ABE 系統中使用的腺嘌呤脫氨酶并不是自然界天然存在的，而是通過多輪定向進化技術人工優化而來的。ABE 系統的工作原理是腺嘌呤脫氨酶首先將識別區域內的腺嘌呤（A）脫去氨基，變成肌苷（I），在DNA 復制過程中，DNA聚合酶會將I 識別為鳥嘌呤（G），使其與C 配對，隨后在DNA 復制過程中I-C 配對會被修正為G-C，實現A-T 堿基對到G-C 堿基對的轉換。

圖3 ABE 系統的工作原理 [6]

在CBE 和ABE 系統誕生后，多個團隊先后對單堿基編輯系統進行了優化，提高了編輯效率，豐富了堿基轉換類型，降低了單堿基編輯器的脫靶效應，擴大了序列識別范圍[7]。相比于CRISPR/Cas9 基因編輯技術，單堿基編輯技術不依賴DSB，對動物基因組的擾動更小，安全風險更低，因此在豬育種研究中，單堿基編輯技術已展現了很好的應用前景[8]。

1.3 先導編輯技術

2019 年，David[9]又開發了全新的基因編輯技術—先導編輯（Prime editing，PE），不同于單堿基編輯技術只能實現有限類型的堿基轉換，PE 技術（圖4）可以實現所有12 種堿基的互換，而且無需供體DNA 即可實現短序列的精確插入和刪除。PE 系統包括一個融合了逆轉錄酶的Cas9 切口酶以及一條先導編輯向導RNA（Prime editing guide RNA，pegRNA）。其中pegRNA 包括3 部分不同的序列，第一部分是單鏈向導RNA（Single-guide RNA，sgRNA），其作用是引導nCas9 與目標DNA 結合；第二部分是引物結合位點（Prime binding site，PBS），用于與nCas9 產生的切口處3 端互補配對；第三部分是逆轉錄模板（RT template including edit），用于引入目的突變。PE 系統的工作原理為nCas9-逆轉錄酶復合體在pegRNA 引導下結合到靶標雙鏈DNA 上，之后nCas9 蛋白再與pegRNA 序列不互補的DNA 鏈產生單鏈切口，切口處3'端與pegRNA 上的PBS 序列互補結合，進而引導逆轉錄酶以PBS 序列下游的RNA 序列為模版進行DNA 合成，形成3' 端編輯Flap 的產物，這時攜帶3' 端編輯Flap 的產物與攜帶5'端非編輯Flap 的產物穩定平衡，其中5'端非編輯Flap 在某些情況下會被細胞內核酸酶切除進而留下一條編輯鏈和一條非編輯鏈的產物，在細胞進行DNA 修復后最終獲得雙鏈都經過編輯的DNA。最初先導編輯的編輯效率相對較低[10]，然而通過不斷的優化，如最佳引物結合解鏈溫度[11]、使用兩種pegRNA[12]、對逆轉錄酶進行修飾[13]等優化，大大提高了先導編輯的編輯效率。

圖4 先導編輯系統工作原理 [9]

2 基因編輯技術在豬育種中的應用

2.1 提高豬抗病性能

疫病一直以來都是困擾畜牧業高質量、穩定發展的難題之一，動物疫病不僅給畜牧業造成巨大的經濟損失，同時也威脅人類健康。例如包括豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmis sible gastroenteritis virus，TGEV）、豬Delta 冠狀病毒（Porcine Delta coronavirus，PDCoV）、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）等多種病毒在內的冠狀病毒屬，是對人類和牲畜健康危險最大的病毒屬之一[14,15]。因此，提高畜禽動物對病原體的抵抗力或耐受力是畜禽育種工作的重要方向。然而，抗病性是一個復雜的多基因性狀，采用傳統的遺傳選擇方法進行抗病育種成本高、耗時長、效率低，同時還存在疫病擴散的風險。此外，疫苗和抗生素的廣泛應用以及批次化生產方式的推廣也在一定程度上削弱了抗病性狀選育的緊迫性。基因工程技術的誕生為畜禽抗病育種提供了新思路和新方法，例如利用基因打靶和轉基因技術成功培育出不含朊病毒蛋白的牛[16]和抗口蹄疫病毒的豬[17]。近年來，基因編輯技術，特別是CRISPR/Cas9 介導的基因敲除/ 敲入和精確修飾技術極大地降低了抗病育種的成本，提高了抗病畜禽新品種的培育效率，能夠有效提升畜禽養殖企業的經濟效益，并為畜牧業高質量、穩定發展提供重要推動力（表1）。

表1 基因編輯技術在豬育種中的應用

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproduc tive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是嚴重威脅全球生豬養殖業健康發展的一種烈性病毒，可導致母豬流產、死胎以及仔豬的大量死亡[18,19]。從2014 年開始，美國密蘇里大學研究團隊利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術先后敲除了與PRRSV感染宿主相關的CD169 以及CD163 基因，分別獲得了CD169 和CD163 基因敲除豬[20]。隨后的攻毒實驗發現無論是直接感染還是與已經感染豬藍耳病病毒的豬飼養在同一豬欄中，CD163 雙等位基因敲除豬對PRRSV 具有完全抗性[21]。Yang 等[22]研究進一步證明CD163 基因敲除豬對高致病性PRRSV 也具有完全的抵抗力。除直接敲除外，通過同源替換[23,24]或精確刪除CD163 蛋白的SRCR5結構域[25-28]，也可以實現對PRRSV 的抵抗。Xu等[29]則利用基因編輯技術對CD163 蛋白第561 位精氨酸進行了精準編輯，將其替換為丙氨酸并獲得了CD163 蛋白單個氨基酸位點突變的基因編輯豬，利用從該基因編輯豬中分離的肺泡巨噬細胞（Porcine alveolar macrophages，PAM）進行體外攻毒實驗，發現該基因編輯豬的PAM 細胞能顯著抑制PRRSV 的感染，這一研究首次實現了單個氨基酸的精準替換，是精準基因編輯育種走向應用的第一步。除了CD163 基因外，Lu 等[30]發現組蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）也具有抗PRRSV活性，在豬體外和體內過量表達HDAC6 可以增強其對PRRSV 的抵抗力。

除PRRSV 外，病毒性腹瀉也是生豬產業的重大威脅之一。常見的豬腹瀉病毒包括TGEV、PEDV、PDCoV 等多種。其中，豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是一種以感染仔豬導致嚴重腹瀉和快速脫水進而致死為主要臨床特征的病毒性腸道疾病，潛伏期短，傳播速度快，發病急，對2 周齡以下的仔豬危害巨大，10 日齡以內仔豬致死率可達100%[31]。成年豬只雖然感染TGEV 后一般不會死亡，但是會使豬只的生長速度變慢，影響其生產效率和生產性能。TGE 發病極為迅速，波及的范圍也很廣，而且常與PEDV、PDCoV 等病毒混合感染，且多發于冬、春季，給生豬養殖業造成了巨大的經濟損失[14,32]。2018 年，美國密蘇里大學首次利用基因組編輯技術獲得pAPN 基因編輯豬，攻毒試驗表明pAPN 基因編輯豬對TGEV 具有抵抗力[33]，但是不能抵抗PEDV。2020 年，Xu 等[19]利用基因編輯技術對CD163 和pAPN 基因進行敲除，成功獲得CD163 和pAPN 雙基因編輯純合子豬，活體攻毒研究表明，該雙基因編輯豬可同時抵抗PRRSV和TGEV 感染，且顯著性抑制PDCoV 的感染；性能測定及屠宰實驗表明該CD163 和pAPN 雙基因編輯豬的繁殖性能和生產性能均與野生型豬無顯著差異。Tu 等[34]通過顯微注射技術和CRISPR/Cas9 基因編輯技術，獲得了CMP-N 糖神經氨酸羥化酶（CMAH）基因敲除豬，攻毒實驗顯示雖然CMAH 基因敲除仔豬表現出PEDV 發病延遲和疾病嚴重程度減輕，但它們對PEDV 并不完全免疫。

除了敲除豬基因組中介導病毒感染的受體基因外，還可以通過在豬基因組中穩定表達抗病毒蛋白進而提高豬的抗病性能。例如將具有抗病毒效果的豬β 防御素2（Porcine β-defensin 2，PBD2）[35]以及蝰蛇蛋白基因（Radical S-adenosyl methionine domain containing 2，RSAD2）基因定點整合到豬基因組中的友好位點[36]，使其在豬的體細胞中穩定表達，可以顯著抑制經典豬瘟病毒（Classic swine fever virus，CSFV）和偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，RPV）等病毒的感染。這些研究表明，基因編輯育種技術可以有效的提高豬對某些疫病的抵抗力和免疫力，在新品種培育方面具有巨大的市場前景[18,37]。

2.2 提高豬的生產性能

生產性能是畜禽養殖中最重要的經濟指標，提高豬的生產性能長久以來都是豬育種的首要目標。Myostatin（MSTN）基因是骨骼肌生長發育的負調控因子，該基因的敲除會導致動物表現出肌肉質量增加的雙肌表型。MSTN 的自然突變已經在牛[57,58]、羊[59]、狗[60]、豬[61]和人類[62]中報道。MSTN 基因敲除豬不僅瘦肉產量顯著增加[63-65]，同時多不飽和脂肪酸水平顯著增加[49,65]。盡管MSTN基因敲除明顯增加了豬的瘦肉率，但在西方商業豬種如大白、長白等品種的MSTN 基因敲除豬中觀察到較為嚴重的仔豬后肢無力現象[61]。Fan 等[49]對多個不同品種的MSTN 基因編輯豬進行了長期的評估，他們開發了一種基于編輯位點的解決方案，可以克服MSTN 基因編輯豬后肢無力的問題，并表明MSTN 基因編輯可以可持續地提高豬的瘦肉產量并增加豬肉中多不飽和脂肪酸含量，而且不會對飼料轉化率或產仔數產生不良影響。類胰島素生長因子2（Insulin like growth factor 2，IGF2）基因也是調控肌肉量的基因，對該基因的精準編輯也可以顯著提高豬肌肉產量。通過CRISPR/Cas9 基因組編輯技術修改IGF2 基因內含子3 中的ZBED6 結合位點，可以極大地提高中國本土豬種如中國巴馬豬和兩廣小花豬的肌肉量[42,43]。

在肉質改良方面，fat-1 脂肪酸去飽和酶基因可以將n-6 多不飽和脂肪酸轉化為n-3 多不飽和脂肪酸，從而提高豬肉品質。Li 等[52]利用CRISPR/Cas9 技術將fat-1 基因敲入到豬Rosa26位點，該基因敲入豬n-3 多不飽和脂肪酸水平顯著上升。You 等[53]通過將fat-1 和IGF-1 基因同時插入豬Rosa26 基因座，制造出了雙基因敲入豬，能夠同時提升豬的肌肉量和肉品質。Zheng 等[54]人采用CRISPR/Cas9 介導的方法，將小鼠解偶聯蛋白1（Uncoupling protein 1，UCP1）cDNA 定點插入豬內源性UCP1 基因座，獲得的UCP1 基因敲入豬脂肪沉積較少，胴體瘦肉率高，而且在寒冷環境中維持體溫的能力有所提高。

2.3 其他性狀改良。

在生豬養殖中，通常會對雄性仔豬進行閹割，這樣一方面可以減少雄性生殖發育的能量消耗，另一方面可以避免雄烯二酮和甲基吲哚等物質影響豬肉的口感。但是仔豬閹割也存在風險，操作不當會引起仔豬感染甚至死亡，降低生產效率，且仔豬閹割也涉及動物福利倫理等問題。Kurtz 等[56]使用CRISPR/Cas9 技術對豬的性別控制基因SRY（Sex determine region Y）的特定區域進行編輯，發現編輯后的雄性仔豬發育出了雌性生殖器官，證明了通過基因編輯技術控制仔豬性別的可行性。

豬是多胎動物，母豬的產仔數與生豬養殖業的經濟效益密切相關。但是母豬繁殖力屬于低遺傳力性狀，通過常規育種技術進行選育費時費力。Shi 等[55]利用CRISPR/Cas9 技術獲得了骨形態發生蛋白15（Bone morphogenetic protein 15，BMP15）基因編輯大白豬，單等位基因編輯母豬初產活仔數可達13 頭，具有高產潛能。除了單一性狀的改良外，基因編輯技術還為豬的多性狀改良提供了可能性，Song 等[8]利用單堿基編輯系統同時對CD163、MSTN 以及IGF2 三個基因進行精確編輯，同時提高了豬的生長性能和抗病性。

3 小結

基因編輯育種技術可以提高動植物遺傳改良的速度，增強我國動植物育種行業的市場競爭力。目前我國在畜禽基因編輯技術應用研究方面已處于國際先進水平，取得了許多具有重大應用價值的成果。未來經過一系列科學、全面的安全評價，這些研究成果有望進一步進入商業化生產。美國在基因編輯動物商業化應用方面走在了世界前列，已于2020 年12 月14 日批準了“Gal-Safe”基因編輯豬可用于食用和醫用，于2022 年3 月7 日又批準了一種基因編輯肉?？捎糜谑秤谩Ｎ覈r業農村部于2022 年1 月24 日發布了 《農業用基因編輯植物安全評價指南（試行）》，并于2023 年4 月28 日發布了 《農業用基因編輯植物評審細則(試行)》，為我國基因編輯動植物的商業化應用奠定了重要的基礎，也將進一步推動我國動植物生物育種的研發與應用。