基于主成分分析和灰色關(guān)聯(lián)度法的白及UPLC特征圖譜及不同商品規(guī)格等級(jí)質(zhì)量研究*

楊曉東，鄧成程，楊文惠，王 玥，肖健平，聶 寰，張 妍，古楚瑩

（1.湖南一方天江藥業(yè)有限公司，湖南 常德 415000；2.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244）

白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.為蘭科多年生草 本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其藥用歷史悠久，具有收斂止血、消腫生肌的功效[1]，臨床常用于咯血、外傷出血、瘡瘍腫毒等。白及主要分布于湖南、貴州、湖北、安徽等省份，其他各地均有少量栽培[2]。白及主要含有聯(lián)芐類(lèi)、二氫菲類(lèi)、菲類(lèi)、聯(lián)菲類(lèi)等成分[3-4]，為常用名貴藥材，市場(chǎng)需求巨大，野生資源十分匱乏[5]。市場(chǎng)上流通的白及大多為統(tǒng)貨，白及藥材商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)亟待更新。

目前，市場(chǎng)中藥材等級(jí)規(guī)格劃分主要以性狀外觀來(lái)評(píng)價(jià)中藥材優(yōu)劣[6-7]，是影響中藥材市場(chǎng)價(jià)格的重要因素。白及屬于塊莖類(lèi)中藥材，在中藥材分級(jí)過(guò)程中常以重量大小為依據(jù)[8]，一般認(rèn)為重量越大，質(zhì)量越好，反之則較差。但有相關(guān)研究表明川芎、天麻、太子參等藥材指標(biāo)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與大小成正相關(guān)[9-11]，白芍、桔梗等藥材指標(biāo)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與大小無(wú)明顯相關(guān)性[10-11]，因此，僅通過(guò)藥材重量大小來(lái)劃分藥材等級(jí)較為片面，往往不能很好地反映中藥材的內(nèi)在質(zhì)量。中藥材商品規(guī)格等級(jí)劃分應(yīng)綜合考慮成分等其他因素。

本研究以白及不同商品規(guī)格為研究對(duì)象，建立超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，結(jié)合主成分分析和灰色關(guān)聯(lián)度模型，旨在為白及的質(zhì)量評(píng)價(jià)和規(guī)格等級(jí)的建立提供合理建議。

1 材 料

1.1 儀器 Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；SQP型萬(wàn)分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SB25-12DTS型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑與試藥 1,4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯（批號(hào)：112061-202102，含量：95.5%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院；甲醇為分析純，磷酸、乙腈為色譜純；水為超純水。

實(shí)驗(yàn)室共收集16批白及藥材，經(jīng)湖南一方天江藥業(yè)有限公司孫冬梅教授鑒定，均為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.的干燥塊莖[1]，且符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》白及項(xiàng)下的各項(xiàng)規(guī)定。根據(jù)產(chǎn)地、市場(chǎng)和文獻(xiàn)調(diào)研將白及分為3個(gè)等級(jí)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，5%A→18%A；4～10 min，18%A→28%A；10～16 min，28%A →40%A；16 ～20 min，40%A →55%A；20 ～22 min，55%A→55%A）；流速為0.35 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量為4 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取1,4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含1,4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯0.15 mg的對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取白及藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率：300 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 特征圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取白及藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩，編號(hào)：S2），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以4號(hào)峰為參照峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白及藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩，編號(hào)：S2），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定。以4號(hào)峰為參照峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取白及藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩，編號(hào)：S2），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以4號(hào)峰為參照峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 特征圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 取16批白及藥材按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012年版），設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，自動(dòng)匹配后多點(diǎn)校正，進(jìn)行全譜峰匹配，生成疊加圖譜。（見(jiàn)圖1）共確認(rèn)9個(gè)特征共有峰，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)4號(hào)峰為1,4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯，以保留時(shí)間適中、峰面積較大的4號(hào)峰作為參照峰（S）[12]。（見(jiàn)圖2）相似度結(jié)果見(jiàn)表2。各批次樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.725，一等品白及和二等品白及之間的相似度為0.503～0.996，一等品白及與三等品白及之間的相似度為0.515～0.988，二等品白及與三等品白及之間的相似度為0.393～0.985，由此可見(jiàn)，不同商品規(guī)格等級(jí)間的白及存在一定的差異性。

圖1 16 批不同商品規(guī)格等級(jí)白及特征圖譜

圖2 特征圖譜共有峰的指認(rèn)

表2 相似度結(jié)果

2.5 主成分分析 將16批白及樣品特征圖譜中的9個(gè)共有峰的峰面積/稱(chēng)樣量導(dǎo)入SPSS 20.0軟件[13]，進(jìn)行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值及其方差。（見(jiàn)表3）由表3可知，前2個(gè)成分的特征值大于1，即4.463和2.811，對(duì)總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)80.817%，具有很好的代表性，可顯示白及特征圖譜共有峰的大部分信息。同時(shí)結(jié)合觀察碎石圖（見(jiàn)圖3）可知，圖中曲線有明顯拐點(diǎn)，說(shuō)明前2個(gè)成分顯示出白及藥材間的大部分信息。成分矩陣見(jiàn)表4。由表4可知，第1主成分主要反映了白及特征圖譜峰2、峰4、峰5、峰6和峰8的信息，第2主成分主要反映了白及特征圖譜峰1、峰3、峰7和峰9的信息。

圖3 主成分分析碎石圖

表3 特征值及累積方差貢獻(xiàn)率

表4 主成分分析矩陣

采用SPSS 20.0軟件對(duì)上述主要成分載荷值進(jìn)行分析，以各自主成分載荷向量除以各自主成分特征值的算術(shù)平方根得到主成分系數(shù)[14]，各主成分的線性模型如下：F1=-0.055X1+0.454X2-0.087X3+0.385X4+0.458X5+0.450X6-0.074X7+0.453X8-0.118X9；F2=0.390X1-0.058X2+0.548X3+0.233X4+0.009X5+0.080X6+0.545X7+0.119X8+0.410X9，F(xiàn) =0.496F1+0.312F2。其中，F(xiàn)1、F2分別表示第1、2個(gè)主成分得分，F(xiàn)表示綜合得分，X1～X9分別表示9個(gè)共有峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。計(jì)算后，得到各批白及樣品的綜合得分。（見(jiàn)表5）整體而言，一等品白及得分最低，三等品白及得分最高。

表5 綜合得分排序

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度 為了進(jìn)一步探究不同商品規(guī)格等級(jí)白及的質(zhì)量差異，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)不同商品規(guī)格等級(jí)白及進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。設(shè)有m個(gè)總樣本，每個(gè)樣本n個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，由此組成的一個(gè)評(píng)價(jià)單元序列｛Xik｝（i=1、2、3、4…m；k=1、2、3、4…n；在本研究中i=16，k=9）。

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)化處理 由于樣本不同指標(biāo)之間量綱不統(tǒng)一，故需對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行變換處理[15]，處理公式為Yik=Xik/Xk（Yik為標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)，Xk為第m個(gè)樣品第k個(gè)指標(biāo)的均值）。

2.6.2 關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 灰色關(guān)聯(lián)度最優(yōu)參考序列和最差參考序列[16]分別為｛XSK｝和｛Xtk｝（k=1，2，3…n）。計(jì)算各評(píng)價(jià)單元相對(duì)于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)。

相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算公式如下：

式中，Δmin=min|Yik-Ysk|，Δmax=max|Yik-Ysk|，（i=1，2，3…m）；ρ為0.5。相對(duì)于最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算公式如下：

式中，Δ'min=min|Yik-Ytk|，Δ'max=max|Yik-Ytk|，（i=1，2，3…m），Ytk為各個(gè)成分對(duì)應(yīng)Yik的最大值；ρ為0.5。

2.6.3 關(guān)聯(lián)度和相對(duì)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)度為：

相對(duì)于最差參考序列的關(guān)聯(lián)度為：

評(píng)價(jià)單元的相對(duì)關(guān)聯(lián)度計(jì)算公式如下：

根據(jù)相對(duì)關(guān)聯(lián)度的大小對(duì)評(píng)價(jià)單元序列進(jìn)行排序，得到質(zhì)量排序結(jié)果[17]。結(jié)果見(jiàn)表6，不同商品規(guī)格等級(jí)的白及存在差異性，整體而言，三等品白及得分最高，一等品白及得分最低。

表6 不同商品規(guī)格等級(jí)白及相對(duì)關(guān)聯(lián)度

3 討 論

本研究采用梯度洗脫，在前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動(dòng)相，最終選定乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。在上述條件下，色譜峰分離度和理論板數(shù)等均較好。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)系統(tǒng)考察了提取溶劑、提取方法及提取時(shí)間對(duì)整體色譜峰的影響。當(dāng)溶劑為80%甲醇、料液比為1∶50（g/mL）、超聲時(shí)間為30 min時(shí)，提取效率和峰型較好，故選擇上述方法作為白及藥材的提取方法。

中藥指紋/特征圖譜等多指標(biāo)成分整體質(zhì)量控制已成為中藥質(zhì)量控制必然發(fā)展趨勢(shì)[18-19]。化學(xué)模式識(shí)別的方法與指紋/特征圖譜分析相結(jié)合，能準(zhǔn)確判斷白及不同商品規(guī)格等級(jí)之間的差異，可以作為初步判斷中藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的判別標(biāo)準(zhǔn)[20]。本研究以白及藥材特征圖譜的9個(gè)共有峰為指標(biāo)，對(duì)比相似度可知不同商品規(guī)格等級(jí)的白及間存在明顯差異，結(jié)合主成分分析與灰色關(guān)聯(lián)度對(duì)不同商品規(guī)格等級(jí)的白及樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。結(jié)果顯示三等品白及得分最高，質(zhì)量最好，一等品白及得分最低，質(zhì)量最差。原因可能與白及的生長(zhǎng)方式有關(guān)，不同年份的白及通過(guò)分叉莖連接，上一年生的白及需要為后續(xù)白及生長(zhǎng)提供部分營(yíng)養(yǎng)[21]。另一方面隨著社會(huì)的進(jìn)步，農(nóng)業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)在中藥材生產(chǎn)中存在不科學(xué)施用化肥、激素、農(nóng)藥等促進(jìn)藥材高產(chǎn)的現(xiàn)象，導(dǎo)致藥材性狀發(fā)生顯著變化，體現(xiàn)為中藥材個(gè)頭增大、種植年限縮短。但中藥材也不能單以重量較小的入藥，容易造成藥材資源浪費(fèi)的同時(shí)還會(huì)降低農(nóng)民種植的積極性，不利于中藥行業(yè)的健康發(fā)展。因此，需要對(duì)白及的大小、采收時(shí)間和藥材質(zhì)量等多個(gè)方面進(jìn)行綜合考量，以期為白及藥材的質(zhì)量控制及種植采收提供理論指導(dǎo)，而且對(duì)于白及規(guī)范化種植、提升藥材質(zhì)量和臨床療效也有積極的意義。