植物乳桿菌發酵提取未成熟琯溪蜜柚果實果膠工藝優化

丁紅霞 楊遠帆,2,3 黃淑安 倪 輝,2,3

柚類水果是中國南方廣泛種植的水果之一。其中,琯溪蜜柚是福建省平和縣種植量最大的水果之一。自2015年以來,琯溪蜜柚年產量超過120萬t,年出口量超過14萬t[1]。在柚類水果種植過程中會有大量未成熟柚類果實(immature pomelo fruit,IPF)產生,約占柚類水果總生產量的20%～50%[2]。這些殘次果不僅造成巨大的資源浪費,還會污染環境。有研究表明,IPF中含有較高的精油[3]和果膠[4]。其中,果膠是一種存在于植物組織中的復合雜多糖,因具有獨特的凝膠特性被廣泛應用于食品、藥品等領域,這可能是未成熟柚類果實潛在的有效利用途徑。

目前,工業上主要采用酸堿法進行果膠提取,但酸堿溶液易腐蝕提取設備,并對環境產生不利影響[5]。研究表明,酵母菌[6]、乳酸菌[7]、曲霉[8]等微生物同樣可以用于植物果膠提取。發酵法提取果膠是利用微生物代謝產生的酶和酸類物質破壞植物細胞壁,從而釋放出果膠類物質[9],具有反應條件溫和、耗能低、環境污染低等優點[10]。從目前來看,有關微生物發酵法提取果膠的研究尚未應用至柚類水果的未成熟果實中。乳酸菌在發酵過程中會產生乳酸等酸性物質[11],酸性物質可將植物中非可溶性果膠轉化為可溶性果膠,從而促進果膠的溶出[12],同時,乳酸菌在發酵時會產生果膠酶,也可有效促進植物組織中的果膠提取[13-14]。此外,植物乳桿菌等乳酸菌發酵提取的果膠多糖具有較好的結構和理化性質[15]。

研究擬以果膠提取率為指標,對植物乳桿菌發酵未成熟琯溪蜜柚果實提取果膠的工藝參數(接種量、發酵時間及液料比)進行優化,并分析植物乳桿菌發酵提取果膠的性質,旨在為利用未成熟柚類果實生產果膠提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未成熟琯溪蜜柚果實:未成熟琯溪蜜柚果實切片后于60 ℃烘干、粉碎,過60目篩備用,福建省平和縣農業技術推廣站;

乳酸菌菌粉:含有1×1010CFU/g的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),山東中科嘉億生物工程有限公司;

MRS肉湯:廣東環凱微生物科技有限公司;

濃硫酸、無水乙醇:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;

咔唑:分析純,上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平:ME104E/02型,梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

酶標儀:Epoch 2 T型,美國伯騰公司;

生化培養箱:ZWYR-2102型,上海智城分析儀器制造有限公司;

雙人單面超凈工作臺:SW-CJ-2FD型,蘇州凈化設備有限公司;

立式壓力蒸汽滅菌器:YXQ-LS-30SH型,上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 果膠提取工藝 精確稱取一定量的原料與蒸餾水混合后裝入三角瓶中,用16層紗布及牛皮紙封口,121 ℃滅菌15 min。將植物乳桿菌粉于MRS肉湯培養液中37 ℃活化,制得植物乳桿菌懸浮菌液,按照一定的接種量(以體積量計)接種到滅菌的原料中,混勻,37 ℃靜置發酵一定時間。

1.3.2 單因素試驗

(1) 接種量:固定發酵時間24 h,液料比20∶1 (mL/g),分別選取接種量為8%,10%,12%,14%,16%(以體積量計)進行試驗,確定最佳接種量。

(2) 發酵時間:固定接種量12%,液料比20∶1 (mL/g),分別選取發酵時間為12,24,36,48,60 h進行試驗,確定最佳發酵時間。

(3) 液料比:固定接種量12%,發酵時間24 h,分別選取液料比為10∶1,15∶1,20∶1,25∶1,30∶1 (mL/g)進行試驗,確定最佳液料比。

1.3.3 正交試驗設計 在單因素試驗基礎上,以果膠提取率為考察指標,對接種量、發酵時間和液料比進行三因素三水平正交試驗,采用L9(34)正交試驗進一步優化IPF果膠提取工藝參數。

1.3.4 果膠提取率測定 采用硫酸咔唑比色法[16]。以吸光度為縱坐標,半乳糖醛酸標準溶液質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線y=0.006 4x+0.005 9,R2=0.996 9,并按式(1)計算果膠提取率。

(1)

式中:

Y——果膠提取率,%;

c——標準曲線上的半乳糖醛酸質量濃度,μg/mL;

m1——烘干的果膠質量,g;

m2——稱取的果膠樣品質量,g;

M——樣品質量,g。

1.3.5 理化指標測定

(1) 酯化度:參照Silva等[17]的方法并修改。取0.1 g樣品加少量無水乙醇濕潤后溶于20 mL蒸餾水中,35 ℃水浴2 h,用0.1 mol/L NaOH調pH至8.2,加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液靜置2 h,加入10 mL 0.1 mol/L HCl溶液,用0.1 mol/L NaOH調pH至8.2,按式(2)計算果膠酯化度。

(2)

式中:

R——酯化度,%;

V1——第一次滴定NaOH溶液消耗體積,mL;

V2——第二次滴定NaOH溶液消耗體積,mL。

(2) 持水性和持油性:參照Saeidy等[18]的方法并修改。取0.1 g樣品于離心管中,加入20 mL蒸餾水(或10 mL花生油),混勻攪拌1 min,8 000 r/min離心10 min,除去上清液,記錄離心管與樣品總質量,按式(3)計算持水性和持油性。

(3)

(4)

式中:

X1——持水力,g/g;

X2——持油力,g/g;

m1——樣品質量,g;

m2——樣品吸水前質量,g;

m3——樣品吸水后質量,g;

m4——樣品吸油前質量,g;

m5——樣品吸油后質量,g。

(3) 蛋白質含量:參照Aklilu等[19]的方法。

(4) 乳化性和乳化穩定性:參照Saeidy等[18]的方法。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3次,采用Excel和SPSS 19.0軟件對數據進行處理及制圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種量對果膠提取率的影響 由圖1可知,隨著植物乳桿菌接種量的增加,果膠提取率呈先上升后下降再逐漸趨于平緩的趨勢。當接種量為12%時,果膠提取率達最大(8.10%)。繼續增大接種量,果膠提取率下降,可能是接種量過多,發酵底物中的營養物質被消耗殆盡,不足以維持菌種生長、產酶及產酸,從而導致果膠提取率下降[20]。因此,接種量取12%左右進行正交試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.2 發酵時間對果膠提取率的影響 由圖2可知,發酵初期,果膠提取率隨發酵時間的延長有一定增加,發酵至24 h時果膠提取率(9.08%)達最大;隨后果膠提取率趨于平穩。在乳酸菌發酵提取貢水白柚皮膳食纖維中也存在類似現象[21],可能是發酵初期乳酸菌產生了一定量的酶和酸,促進果膠釋放,而24 h后發酵底物中營養物質逐漸被消耗,菌種生長及產酸能力下降,從而導致果膠提取率下降[22-23]。因此,發酵時間取24 h左右進行正交試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.3 液料比對果膠提取率的影響 由圖3可知,隨著液料比的增加,果膠提取率呈先上升后趨于平穩的趨勢。當液料比>20∶1 (mL/g)時,果膠提取率穩定在8.31%左右。植物乳桿菌發酵過程中,會產生一定量的酶和酸,隨著液料比的增加,發酵液中各營養物質將達到最適發酵濃度,促進酶與酸的產生,從而增強與柚子果實的作用,果膠提取率提高;但液料比增加到一定程度時,發酵液中的酸與酶對柚子果實的作用達到平衡,增加液料比,果膠提取得率不會再增加[22]。因此,液料比取25∶1 (mL/g)左右進行正交試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 正交優化試驗

根據單因素試驗結果,選擇合適的參數范圍進行正交試驗優化,試驗因素水平見表1,試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設計及結果

由表2可知,最佳的發酵條件為接種量14%,液料比25∶1 (mL/g),發酵時間12 h;各因素對果膠提取率的影響由大到小依次為料液比>發酵時間>接種量。

植物乳桿菌發酵未成熟琯溪蜜柚果實提取果膠的最優工藝條件為接種量14%、料液比25∶1 (mL/g)、發酵時間12 h,在此條件下進行3次平行驗證實驗,測得果膠平均提取率為11.60%,與表2中最大果膠提取率相似。

2.3 未成熟琯溪蜜柚果實果膠性質分析

經檢測,采用植物乳桿菌發酵法提取的未成熟琯溪蜜柚果實中果膠的半乳糖醛酸含量為26.13%、酯化度為68.58%、蛋白質含量為1.57%、持水性與持油性分別為0.53,7.01 g/g、乳化性以及乳化穩定性分別為14.33%和33%。檢測數據表明,IPF果膠屬于高酯化度果膠,根據高酯化度果膠對酸度(pH<3.5)和糖度(>55%)的要求,該IPF果膠可應用于果醬、糖果以及酸奶等食品工業。持水性與持油性主要受果膠密度及表面微觀結構等特性影響,在食品工業用于改善產品的硬度和黏度[24]。IPF果膠的持水性與持油性略高于Muoz-Almagro等[25]提取的漿果果膠,可能是發酵過程中產生的酶作用于IPF中的果膠,使其結構被破壞,呈疏松多孔狀,從而增大了水或油與果膠的接觸面積,因此持水性和持油性增大[26];IPF果膠中蛋白質含量符合糧農組織的建議(<15.6%),其乳化活性和乳化穩定性低于李揚[27]提取的狐臭柴葉片果膠,可能與蛋白質含量會影響果膠的乳化性能有關[28]。

3 結論

利用植物乳酸菌發酵提取未成熟琯溪蜜柚果實中的果膠,其最適提取工藝條件為乳酸菌接種量14%、液料比25∶1 (mL/g)、發酵時間12 h,此條件下果膠提取率為11.60%,半乳糖醛酸含量為26.13%、酯化度為68.58%、蛋白質含量為1.57%、持水性與持油性分別為0.53,7.01 g/g、乳化活性以及乳化穩定性分別為14.33%和33%。試驗僅探究了發酵因素對果膠提取率的影響,后續可以對果膠的其他性質如凝膠性、熱穩定性或結構等進行深入分析。