山茱萸多糖提取工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)表征

肖付才 李穎奎 黃 斐 谷俊華

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)被廣泛種植于河南、浙江、山西、安徽、湖南和湖北等地[1]。先前的報(bào)道發(fā)現(xiàn)山茱萸果實(shí)中富含多酚、多糖、類黃酮、皂苷、各種維生素和礦物質(zhì)等活性成分[2]。大量研究[3]表明,山茱萸多糖可抑制炎癥因子的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的生長、清除過量自由基和調(diào)節(jié)免疫相關(guān)的因子等功效。因此,山茱萸多糖具有較好的應(yīng)用和開發(fā)前景。高效獲得山茱萸多糖是至關(guān)重要的。

目前,熱水提取法(hot water extraction,HWE)是天然多糖提取的主要方式。HWE具有提取成本低和便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),但該方式存在提取效率低和耗時(shí)長等缺點(diǎn),這限制其在天然多糖提取中的應(yīng)用[4]。微波輔助提取(microwave assisted extraction,MAE)是依據(jù)微波特殊的加熱方式使得提取液溫度快速升高,微波輻射破裂植物細(xì)胞壁,提高目標(biāo)成分得率[5-6]?？祖路嫉萚7]采用MAE法提取地黃多糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與HWE法的多糖得率相比,MAE法獲得多糖得率提高了5倍。Thirugnanasambandham等[8]通過MAE法提取桑葉中的多糖,并利用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明,當(dāng)樣品重量、微波功率和提取時(shí)間分別為20 g、170 W和10 min時(shí),多糖得率獲得最大值(9.41%)。相較于HWE法,MAE法提取效率顯著提升和提取時(shí)間顯著縮短。湯慧民等[9]利用MAE法提取核桃殼多糖并評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明,MAE法獲得的多糖得率(2.24%)顯著高于HWE法(1.06%),且MAE法獲得的多糖對(duì)自由基的清除能力也顯著優(yōu)于HWE法的。超聲輔助提取(ultrasonic-assisted extraction,UAE)作為一種新穎的非熱加工技術(shù),是利用“空化效應(yīng)”加速植物細(xì)胞壁的破裂,提高目標(biāo)成分得率,但在提取過程中,超聲的“空化效應(yīng)”可能會(huì)破壞多糖中的糖苷鍵,進(jìn)而降低多糖得率,這限制了UAE法在天然多糖提取領(lǐng)域中的應(yīng)用[10]。酶法輔助提取(enzymatic assisted extraction,EAE)是利用酶的高效性和專一性水解植物細(xì)胞壁,加速植物細(xì)胞壁的降解和提高目標(biāo)成分的得率[10-11]。目前,越來越多的學(xué)者利用EAE技術(shù)從天然資源中提取天然多糖。趙惠茹等[12]利用EAE法從刺玫果中提取多糖,優(yōu)化多糖提取工藝并評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明,當(dāng)酶添加量、酶處理時(shí)間和料液比分別為1.37%、71 min和1∶30 (g/mL)時(shí),多糖得率最大(16.38%),其多糖對(duì)自由基清除有較好的效果?？阻吹萚13]采用果膠酶輔助提取法從藍(lán)莓中提取多糖并評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明,果膠酶輔助提取法所得的多糖得率(2.72%)顯著高于HWE法的(1.35%),且MAE法獲得的多糖的抗氧化活性顯著優(yōu)于HWE法的。劉軍波等[14]采用EAE法從荷葉中提取多糖。結(jié)果表明,EAE法提取獲得的多糖的得率(9.66 g/100 g)顯著高于傳統(tǒng)的HWE法(4.12 g/100 g)。但以上多糖的提取方式均采用單一的提取溶劑,所得粗多糖包含大量雜質(zhì),后續(xù)純化過程繁瑣和成本高。

近年來,雙水相提取(aqueous two-phase extraction,ATPE)技術(shù)作為一種綠色高效的提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多糖的提取。ATPE技術(shù)具有提取成本低、純度高、便于連續(xù)化提取目標(biāo)成分等優(yōu)點(diǎn)[15]。目前,利用ATPE法從天然資源中提取活性成分的研究備受關(guān)注。Niphadkar等[16]通過ATPE法從馬鈴薯皮中提取多酚氧化酶,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝。結(jié)果表明,最優(yōu)的ATPE工藝為:聚乙二醇17.62%、磷酸鉀緩沖液15.11%、NaCl濃度2.08 mmol/L和pH 7,在此條件下,多酚氧化酶最大分配系數(shù)、純化因子和得率分別為3.7、4.5和77.8%。Gao等[17]利用ATPE法提取油茶多糖,并利用柱色譜技術(shù)進(jìn)一步純化多糖。結(jié)果表明,經(jīng)ATPE法提取得到的油茶多糖純度顯著高于傳統(tǒng)的HWE和UAE法,進(jìn)一步證實(shí)ATPE法可一步完成提取和樣品的初步純化。Ji等[18]采用ATPE法從銀耳中提取總黃酮,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝。結(jié)果表明,ATPE銀耳總黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%、NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.18%、萃取時(shí)間8.25 min。該條件下,總黃酮的最大提取率為0.158 mg/g。微波提取與雙水相提取相結(jié)合形成一種新的提取方式,即微波輔助雙水相提取法(microwave assisted aqueous two-phase extraction,MATPE),既能充分發(fā)揮微波快速、高效提取的優(yōu)勢,又可以獲得高純度的多糖,這可有效避免后續(xù)多糖除蛋白和色素的操作[19-20]。目前,關(guān)于利用MATPE技術(shù)從山茱萸中提取多糖的研究尚未見報(bào)道。此外,針對(duì)MATPE技術(shù)所得的山茱萸多糖粗提物的純化也鮮見報(bào)道。

研究擬采用MATPE法提取山茱萸多糖,探究4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)山茱萸多糖得率的影響;通過柱層析法純化山茱萸多糖粗提物,并鑒定純化后的多糖餾分結(jié)構(gòu),以期為山茱萸的深度開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸:市售;

DEAE-52纖維素和Sephadex G-100:上海浦予工業(yè)科技有限公司;

半乳糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖:純度≥99%,天津佰瑪科技有限公司;

氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸銨、苯酚和濃硫酸:分析純,天津金東天正精細(xì)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式掃描電鏡:SNE-3200M型,深圳市武訓(xùn)科技有限公司;

微波輔助提取儀:AL-IMC1型,北京一葉藍(lán)天科技有限公司;

氣相色譜:GC7600型,深圳?？迫饍x器設(shè)備有限公司;

高效液相色譜儀:ROHS2.0型,蘇州博訊儀器有限公司;

紫外分光光度計(jì):HT-5873型,青島海特爾環(huán)?？萍加邢薰?

真空冷凍干燥機(jī):FXH-3100型,山東泰武機(jī)械設(shè)備有限公司;

高速離心機(jī):AXTG16G型,無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司;

傅里葉變換紅外光譜儀:Hoffen-20型,天津市嘉鑫海機(jī)械設(shè)備有限公司;

植物粉碎機(jī):DF-45A型,溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 將山茱萸果肉于50 ℃烘干至含水率<5%,粉碎,過40目篩子備用。

1.3.2 山茱萸多糖提取物制備 參照Li等[21]的方法。

1.3.3 山茱萸多糖得率測定 參照J(rèn)i等[22]的方法,按式(1)計(jì)算多糖得率。

(1)

式中:

Y——多糖得率,%;

m1——提取物質(zhì)量,g;

m2——山茱萸粉末質(zhì)量,g。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 設(shè)定微波功率為100～500 W,間隔100 W;乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%～55%,間隔5%;硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%～26%,間隔2%;料液比為1∶10～1∶30 (g/mL),間隔1∶5 (g/mL)。

1.3.5 正交試驗(yàn) 通過單因素的結(jié)果,選取微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為正交試驗(yàn)因素,以山茱萸多糖得率為指標(biāo),設(shè)計(jì)L9(33)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.3.6 山茱萸多糖的純化 利用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇沉淀山茱萸粗多糖,收集沉淀,透析48 h,于-18 ℃預(yù)凍12 h,凍干回收樣品,用去離子水復(fù)溶,8 000 r/min離心10 min,收集上清液。上清液以1.5 mL/min的流速加入DEAE-52纖維素柱(2.6 cm×70 cm)中,采用去離子水和不同濃度的NaCl(0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mol/L)溶液依次進(jìn)行洗脫。分離后獲得3個(gè)多糖餾分(COP-1、COP-2和COP-3),其中COP-2的多糖含量最高。通過Sephadex G-100層析柱(1.6 cm×50 cm)進(jìn)一步純化主要餾分COP-2。洗脫參數(shù):加載質(zhì)量濃度10 mg/mL,加載體積4 mL,流速0.4 mL/min。每管收集2 mL,冷凍干燥,獲得均一的多糖餾分(COP-2-S)。

1.3.7 結(jié)構(gòu)鑒定

(1) 紫外光譜:參照Li等[21]的方法。

(2) 單糖組成:參照Liang等[23]的方法。

(3) 分子量:將COP-2-S以1 mg/mL溶解至去離子水中,過0.45 μm濾膜,注入高效凝膠滲透色譜中,利用去離子水進(jìn)行洗脫,隨后測定其平均分子量(Mw)。

(4) 紅外光譜:將COP-2-S與KBr按質(zhì)量比1∶30混勻并壓縮成切片進(jìn)行紅外光譜掃描,分析其紅外吸收特性。

(5) 掃描電鏡:參照Xue等[24]的方式。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 9.0軟件作圖;采用Statistics 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1(a)可知,當(dāng)微波功率為100～400 W時(shí),微波功率與多糖得率呈正相關(guān),主要是由于微波功率越大,溫度升高越快,多糖溶解度越大。此外,高微波功率輻射易加速山茱萸細(xì)胞壁的破裂,降低多糖的擴(kuò)散阻力,促進(jìn)多糖擴(kuò)散,進(jìn)而提高多糖得率[25]。當(dāng)微波功率>400 W時(shí),過高的微波功率會(huì)破壞多糖中的糖苷鍵,降低多糖得率。這與Le等[26]采用MAE技術(shù)從海藻中提取多糖的結(jié)果一致。因此,選擇微波功率范圍為300～500 W。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

由圖1(b)可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)<45%時(shí),多糖得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加(P<0.05)。其原因是較高乙醇體積分?jǐn)?shù)下,山茱萸細(xì)胞內(nèi)多糖的擴(kuò)散系數(shù)與溶解度較高,有助于多糖從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到溶劑中,進(jìn)而使多糖得率升高[27]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)>45%時(shí),多糖得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低,與Lin等[28]的結(jié)果一致。因此,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為35%～45%。

由圖1(c)可知,當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)<24%時(shí),山茱萸多糖得率隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加(P<0.05),當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%時(shí),山茱萸多糖得率達(dá)最大值(11.45±0.16)%。這是由于下相中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高,多糖溶解度越大,進(jìn)而有助于提高多糖得率[21]。此外,在較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨溶液中,多糖具有較高的擴(kuò)散系數(shù),從而有利于多糖的提取。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%～26%時(shí),多糖得率與硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。其原因是下相中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高,會(huì)造成過多的雜質(zhì)被溶解,降低多糖的溶解度[15]。這與Xue等[24]的結(jié)果一致。因此,選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為22%～26%。

由圖1(d)可知,當(dāng)料液比為1∶10～1∶20 (g/mL)時(shí),山茱萸多糖得率隨料液比的增加而增加(P<0.05);當(dāng)料液比>1∶20 (g/mL)時(shí),山茱萸多糖得率隨料液比的增加無顯著變化,與楊占群等[29]的結(jié)果一致。因此,選擇料液比為1∶20 (g/mL)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

山茱萸多糖經(jīng)MATPE法提取的正交試驗(yàn)因素水平見表1,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。由表2可知,各因素對(duì)山茱萸多糖得率影響的主次順序?yàn)锳>B>C,最優(yōu)水平組合為A1B1C1,即微波功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)22%,在此條件下,測得山茱萸多糖得率為(12.04±0.17)%,進(jìn)一步說明利用正交試驗(yàn)優(yōu)化MATPE法提取山茱萸多糖工藝具有可行性,與任俊鵬等[30]的結(jié)果存在一定差異。其主要原因是由于試驗(yàn)利用MATPE法提取多糖,一些雜質(zhì)(色素、寡糖和酯類)被提取到上相,而下相中得到純度較高的多糖。因此,造成MATPE法提取所得多糖得率與超聲輔助提取的存在一定差異,與Tan等[31]的結(jié)論相似。

表1 山茱萸多糖的L9(33)正交試驗(yàn)因素水平表

表2 山茱萸多糖的L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 山茱萸多糖純化

由圖2(a)可知,經(jīng)硫酸—苯酚法測定COP-1、COP-2和COP-3得率分別為9.35%,13.68%,10.21%。由圖2(b)可知,COP-2經(jīng)Sephadex G-100柱層析法純化后,獲得單一的對(duì)稱峰,命名為COP-2-S。

圖2 DEAE-52纖維素柱層析純化山茱萸多糖粗提物的洗脫曲線和Sephadex G-100柱層析純化COP-2的洗脫曲線

2.4 單糖組成和分子量分析

由圖3(a)可知,COP-2-S為單一對(duì)稱峰,說明COP-2-S屬于均一的多糖餾分。以平均分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),保留時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制回歸方程為logMw=10.05-0.257TR,R2=0.999 6。

圖3 COP-2-S分子量分布和單糖組成

COP-2-S的保留時(shí)間為8.6 min,依據(jù)回歸方程計(jì)算COP-2-S的平均分子量為17 450 Da,低于Ji等[22]的結(jié)果。這種現(xiàn)象可能與山茱萸產(chǎn)地、品種、提取和純化方式有關(guān)。由圖3(b)可知,COP-2-S由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和未知單糖組成。由于試驗(yàn)條件限制,試驗(yàn)未對(duì)未知的單糖進(jìn)行分析說明。阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖的物質(zhì)的量比為 12.85∶30.71∶18.09,表明COP-2-S屬于一種具有不同化學(xué)成分的雜多糖,其中葡萄糖為主要單糖。

2.5 紫外光譜和紅外光譜分析

圖4 COP-2-S紫外圖譜和紅外圖譜

2.6 COP-2-S微觀結(jié)構(gòu)分析

由圖5(a)可知,COP-2-S在200×下呈無規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu),1 000×下出現(xiàn)大小不均的孔和棒狀結(jié)構(gòu),表面相對(duì)致密,說明COP-2-S經(jīng)提取純化后,多糖分子發(fā)生了相互聚集,使得結(jié)構(gòu)更加致密。其主要原因是由于多糖作為極性分子,微波體加熱使得多糖分子快速吸收微波能,加速分子聚集,進(jìn)而使得多糖結(jié)構(gòu)更致密[24]。

圖5 COP-2-S的微觀結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明,微波輔助雙水相提取山茱萸多糖的工藝為:微波功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)22%和料液比1∶20 (g/mL),此時(shí)山茱萸多糖得率為(12.04±0.17)%。此外,通過柱色譜技術(shù)純化山茱萸粗多糖最終獲得均一的多糖餾分(COP-2-S),分子量為17 450 Da。COP-2-S具有無規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)。后續(xù)需進(jìn)一步深入研究COP-2-S結(jié)構(gòu)及其生物活性,并闡明其構(gòu)效關(guān)系。