柱撐殼聚糖的氫鍵密堆積結構制備生物安全的高性能保潤材料

高 楠，鄭 悅，李歡歡，臧婉辰，元 野，楊亞杰，金 哲

（東北師范大學化學學院，多酸與網格材料化學教育部重點實驗室, 長春 130024）

保潤劑又稱水結合劑，在化妝品、 醫療保健、 食品和藥品等領域發揮著重要作用［1～6］. 例如，保潤劑可通過模擬皮膚保潤系統，促進水分的吸收. 一方面，保潤劑結合并保留環境中的水分，增加皮膚表面水分濃度，讓水分向皮膚深層擴散； 另一方面，保潤劑形成疏水屏障，減少皮膚表面水分流失，促進水分向皮膚深層擴散. 這類保潤劑主要包括多元醇、 糖類及鹽類等［7～12］，在使用過程中會覆蓋在基質的表面或摻雜在基質的內部［13～16］. 自開發以來，保潤劑得到了快速發展，并廣泛應用于各個領域［17～22］.然而，傳統保潤劑也存在一些問題，例如： 多元醇（如丙二醇和丙二醇）的沸點較低，容易揮發和逸散；高沸點糖類和鹽類具有緊密堆積結構，嚴重降低了水分子的保潤性能［23～26］.

多糖是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵形成的一類天然高分子聚合物，具有來源豐富及分布廣泛的特點，是構成生物體的四大基本物質之一. 現代研究表明，多糖不但具有調節免疫、 血糖、 血脂及抗癌、抗輻射、 抗菌、 抗病毒等多種藥理活性，而且具有毒性低、 來源天然及安全性高等優點，在食品、 藥品和化妝品開發等方面具有廣闊的應用前景. 殼聚糖是天然多糖甲殼素部分乙酰化的產物，具有生物降解和生物相容性及無毒、 抗菌、 抗癌、 降血脂及增強免疫等多種生理功能［27～29］. 基于上述優點，殼聚糖及其衍生物被廣泛應用于食品添加劑、 紡織品、 化妝品、 抗菌劑、 藥物緩釋、 基因轉移載體等生物醫藥及日用化工領域. 研究表明，殼聚糖衍生物的吸水率約為典型保潤劑透明質酸的兩倍. 然而，殼聚糖分子鏈內部含有多重氫鍵，進而促使柔性鏈之間緊密堆積，這種氫鍵密堆積結構嚴重影響了保潤劑的吸水和儲水能力（羥基使用率小于20%）［30～33］.

1969 年，Davankov 等［34］首次報道了以低密度、 剛性、 無定形、 微孔結構為特征的超交聯聚合物（HCP）. 隨后，Lee等［35］以線型聚苯乙烯為前體，采用二乙烯基苯、 對苯二甲酰二氯和氯甲基甲醚等不同交聯劑，通過Friedel-Crafts烷基化反應合成了一系列具有共價橋（苯環）的HCP材料［35］. 隨著HCP材料成為研究熱點，研究人員進行了大量相關材料的研究［35～41］. 超交聯聚合物的最大比表面積可達2090 m2/g，能夠很好地保持多孔結構，用于吸附和儲存能量分子［42～45］. 受HCP固體的啟發，殼聚糖結構單元中的—NH2基團很容易與酸反應形成多孔結構. 本文以苯甲酸為支柱，通過羧酸酐共聚反應制備了殼聚糖基多孔保潤劑，疏水性苯環的存在能夠將殼聚糖的氫鍵密堆積結構柱撐開來（Scheme 1）. 氮氣吸附實驗表明，殼聚糖基多孔保潤劑的比表面積比原來的殼聚糖增加了9倍多. 由于本文充分利用了分子內部的羥基基團，殼聚糖基多孔保潤劑能夠吸附大量水氣，吸附量增加了3倍多，使用殼聚糖基多孔保潤劑的試紙的失水率比使用商用丙二醇的試紙低20%以上.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

苯甲酸，純度98%，北京J＆K百靈威試劑公司； 殼聚糖，純度98%，美國Fluka有限公司； 對甲基苯磺酸，純度99%，上海Macklin有限公司； Hela細胞，武漢Procell生命科技有限公司； 胎牛血清的Iscove改良杜爾貝科培養基（IMMM，Gibco BRL），美國Sigma-Aldrich 公司； 噻唑藍（MTT）檢測試劑盒（Promega），上海酶聯生物科技有限公司； 小鼠（雌性，42～56 d，體重18～23 g），河北億思生物科技有限公司.

Nicolet Impact 410型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國Nicolet公司； Bruker D8 QUEST型X射線衍射儀（XRD），德國布魯克公司； Netzch Sta 449c 型熱重分析儀（TGA），德國耐馳Netzsch 公司； JEOS JSM 6700 型掃描電子顯微鏡（SEM）和JEM-2100 型透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL 電子株式會社；Quantachrome Autosorb-IQ型氣體吸附分析儀，美國康塔儀器公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 殼聚糖基多孔保潤劑的合成 在200 mL 反應釜中加入29.57 g 苯甲酸、 59.14 g 殼聚糖和1500 mL 甲苯. 攪拌30 min 后，將15.00 g對甲基苯磺酸（催化劑）緩慢加入上述混合物中［30～32］. 然后對溶液體系進行程序加熱： 先在50 ℃下反應6 h，然后加熱到90 ℃反應12 h. 加水回流10 h后，停止反應并過濾除去鹽分，得到殼聚糖基多孔保潤劑.

1.2.2 殼聚糖基多孔保潤劑的負載 將250 mg 殼聚糖基多孔保潤劑分散在5 mL 水中. 攪拌30 min后，將上述溶液均勻噴灑在50 g試紙上，然后將試紙置于恒溫恒濕培養箱中培養48 h，使多孔保潤劑與試紙充分滲透. 即得到殼聚糖基多孔保潤劑負載的試紙.

1.2.3 細胞毒性試驗 將Hela細胞在添加了5%（質量分數）胎牛血清的Iscove改良杜爾貝科培養基中培養，培養條件為37 ℃，5%（體積分數）CO2的空氣. 在90 μL新鮮培養基中，以每孔10000個細胞的密度培養于96孔板上. 使用改良的MTT 檢測試劑盒（Promega）檢測細胞毒性. 用自動平板閱讀器在490 nm波長下測定甲狀腺素的吸附值.

1.2.4 小鼠毒性試驗 所有小鼠均分組飼養（6 只/籠）； 光-暗循環，溫度（24±2） ℃，濕度（60±5）%，隨機提供食物和水. 所有動物護理和實驗程序均符合國際標準. 通過雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定血清中IL-6和TNF-a的水平.

小鼠按體重口服10 mg/kg的殼聚糖基多孔保潤劑12 h后，迅速取出主要器官組織（心、 肝、 脾、 肺和腎），放入液氮中冷卻. 隨后，在超低溫下對上述樣本進行切片，用蘇木精-伊紅（HE）染色法進行熒光染色.

2 結果與討論

2.1 樣品的結構和形貌表征

將殼聚糖分子于甲苯溶液中浸泡30 min，然后向上述體系中緩慢加入苯甲酸和對甲基苯磺酸. 將混合物加熱至50 ℃反應6 h，再于90 ℃回流12 h，得到殼聚糖基多孔保潤劑. 由圖1（A）可以看出，所制備的保潤劑在1557 和804 cm-1處出現了C=C 伸縮振動和苯環C—H 平面外彎曲振動的特征峰； 同時，位于3422 cm-1處—NH2的伸縮振動峰強度與殼聚糖相比明顯降低，而位于1520 cm-1處的源于苯甲酸羧基的—C=O伸縮振動帶明顯增強. 上述特征峰的變化清楚地表明酸和氨基發生了中和反應，成功制備了殼聚糖基多孔保潤劑.

通過X射線衍射分析對殼聚糖基多孔保潤劑的結晶特性進行了表征. 參照殼聚糖基多孔保潤劑的制備條件對殼聚糖分子進行了處理，將其浸入甲苯溶液中30 min，然后將混合物加熱至50 ℃反應6 h，再于90 ℃回流12 h. 由圖1（B）可見，殼聚糖基多孔保潤劑粉末沒有出現明顯的衍射峰. TGA 結果表明，隨著溫度的升高，殼聚糖基多孔保潤劑有兩個失重過程. 第一階段失重范圍在200～400 ℃，對應低聚物成分的逸出； 第二階段失重范圍在400～550 ℃，歸因于多孔保潤材料的骨架分解. 以上結果表明，殼聚糖基多孔保潤劑的結構穩定溫度應該低于200 ℃，因此后期的摻雜和應用實驗中，將操作溫度控制在200 ℃以內.

Fig.1 FTIR spectra(A) and XRD patterns(B) of chitosan(a) and chitosan-based porous humectant(b)

SEM照片［圖2（A）］顯示，殼聚糖基多孔保潤劑是由粒徑為250～500 nm的小尺寸納米粒子團聚而成的，可以均勻地分散在試紙表面. TEM照片［圖2（B）］顯示出殼聚糖基多孔保潤劑具有無定形結構.

Fig.2 SEM image(A) and TEM image(B) of the chitosan-based porous humectant

2.2 樣品的氣體分子吸附性能

由圖3（A）結果計算得出，殼聚糖粉末的Brunauer-Emmett-Teller（BET）比表面積（SBET）僅為2.7 m2/g，這是因為殼聚糖鏈之間通過氫鍵形成了緊密的堆積結構. 經苯甲酸填充后，殼聚糖基多孔保潤劑的SBET超過了28.5 m2/g. 此外，殼聚糖基多孔保潤劑的孔體積從0.01 cm3/g增加到約0.065 cm3/g.這些變化歸因于殼聚糖基多孔保潤劑中的剛性結構單元苯甲酸削弱了殼聚糖鏈的層間氫鍵相互作用，從而有利于客體分子的吸附和儲存. 同時，利用密度泛函理論（DFT）方法計算了殼聚糖基多孔保潤劑樣品的孔徑. 殼聚糖基多孔保潤劑的孔徑分布在8.2 nm左右，與殼聚糖（平均孔徑2.6 nm）相比明顯增大［圖3（B）］. 孔體積和孔徑的增大有力地證明了苯環片段能有效地將殼聚糖分子鏈柱撐開，從而形成較大的孔體積和較寬的孔徑.

Fig.3 N2 adsorption-desorption isotherms(A) and pore size distribution(B) of Chitosan and chitosan-based porous humectant

由圖4可見，殼聚糖樣品的水蒸氣吸附容量僅為5.0 cm3/g，而殼聚糖基多孔保潤劑的吸附容量提高到21.6 cm3/g. 殼聚糖基多孔保潤劑水蒸氣容量對比殼聚糖樣品提升3 倍多，這一提升能力遠超過甘油、 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽以及膠體粒子網絡保潤劑材料［46～48］. 上述發現進一步證實，由于苯甲酸的柱撐作用，殼聚糖鏈之間的緊密堆積結構被破壞. 此外，殼聚糖基多孔保潤劑的吸附和解吸等溫線之間存在明顯的滯后環，證明殼聚糖基多孔保潤劑與水分子的相互作用能力很強.

Fig.4 Water adsorption-desorption isotherms of chitosan and chitosan-based porous humectant

2.3 樣品的安全性分析

對于應用于人體的材料，需要預先考慮和嚴格證明其毒性在安全使用的范圍. 因此，在進行進一步的保潤應用之前，采用MTT法檢測殼聚糖基多孔保潤劑及其組合物的潛在生物毒性. 圖5（A） 結果表明，與Hela細胞共同培養后，殼聚糖、 苯甲酸、 丙二醇和殼聚糖基多孔保潤劑都沒有明顯的細胞毒性. 濃度差實驗表明，殼聚糖基多孔保潤劑在濃度高達20 mg/mL 時仍然沒有明顯的細胞毒性［圖5（B）］.

Fig.5 Results of MTT assays using Hela cell（A） Humectant： a. Chitosan； b. benzoic acid； c. propyl glycol； d. chitosan-based porous humectant.（B） Chitosan-based porous humectant of deifferent concentrations. Control： no humectant.

此外，給小鼠口服10 mg/kg的殼聚糖基多孔保潤劑12 h后，制作主要器官組織（心、 肝、 脾、 肺和腎）的組織切片，并用蘇木精-伊紅（HE）染色. 結果表明，所有器官組織均未發現明顯的器官損傷（圖6），進一步證實了殼聚糖基多孔保潤劑沒有生物毒性.

Fig.6 Tissue sections of the major organ tissues(heart, liver, spleen, lung and kidney) of the mice without(up) and with(down) chitosan-based porous humectant oral administration 10 mg/kgThe sections were stained with hematoxylin-eosin（HE）. scale bar： 200 μm.

2.4 樣品的保潤性能

采用恒溫水蒸氣脫附法對殼聚糖基多孔保潤劑的保潤性能進行了系統測試. 將殼聚糖基多孔保潤劑粉末按照1∶200的質量比添加到空白試紙中. 同時，選擇空白試紙和添加了傳統保潤劑丙二醇的試紙作為參照物. 在恒溫25 ℃和不同濕度條件下，對試紙的含水量進行了測試. 由表1可見，在相對濕度（RH）為30%和80%時，單純試紙的含水量變化率分別為70.25%和66.26%； 加入傳統保潤劑丙二醇后，含水量的變化率變化不大，分別為69.21%和76.96%； 當將殼聚糖基多孔保潤劑噴灑在試紙上時，含水量的變化率明顯降低，分別為56.33%和60.87%.

Table 1 Comparison of the water adsorption-desorption behavior of the chitosan-based porous humectant

與丙二醇相比，殼聚糖基多孔保潤劑在30%和80%相對濕度條件下的保水能力分別提高了18.61%和20.91%，這一結果表明，殼聚糖基多孔保潤劑對試紙基材具有顯著的保濕性能，與市場上廣泛使用的丙二醇相比，其保潤性能明顯提高. 在已報道的常用保潤劑（包括丙三醇、 丙二醇、 木糖醇、 甘油、 山梨糖醇、 糖類和其它化學物質等）中達到最高水平［49，50］.

3 結 論

通過簡單的中和反應合成了一種新型殼聚糖基多孔保潤劑. 疏水性的苯環之間可以通過π-π作用形成疏水性區域，進而改變殼聚糖鏈之間的排列模式，破壞原始的氫鍵密堆積結構，形成大尺寸的空穴. 與原始殼聚糖相比，殼聚糖基多孔保潤劑的比表面積增加了近10倍. 并且，細胞安全性實驗和小鼠安全性測試表明，殼聚糖基多孔保潤劑沒有明顯的細胞毒性，且小鼠口服之后，蛋白質水平均無明顯變化，證實了殼聚糖基多孔保潤劑沒有生物毒性. 負載殼聚糖基多孔保潤劑的試紙的失水率與商用丙二醇負載的試紙相比降低了20%以上. 本文展示了一種制備殼聚糖基保潤劑的簡單方法，可為今后設計高性能多孔吸附劑提供了參考.