間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體治療干眼的研究進(jìn)展

張明杰,李從心,溫 瑩

0引言

干眼是一種慢性進(jìn)行性疾病,常見癥狀包括眼干、眼紅、眼痛、異物感和視物模糊,嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量,增加家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),隨著干眼發(fā)病率的逐年攀升,已然成為一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生問題。干眼的主要特征是淚膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失并伴有眼部癥狀,其中淚膜不穩(wěn)定和高滲、眼表炎癥和損傷以及神經(jīng)感覺異常是導(dǎo)致干眼的重要機(jī)制[1],因此,控制炎癥和免疫反應(yīng)是預(yù)防和治療慢性干眼的基礎(chǔ)。當(dāng)前治療干眼的手段主要包括人工淚液替代、抗炎、局部免疫抑制等藥物治療,但這些治療方法主要局限于改善眼表不適等癥狀,對于一些重度干眼患者的治療效果相對較差。近年來,隨著再生醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展,干細(xì)胞療法表現(xiàn)出對干眼的治療潛力。

干細(xì)胞可以分為成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞,其中間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是最重要的成體干細(xì)胞之一,具有自我更新和多向分化潛能[2],其良好的分化能力、體外擴(kuò)增以及免疫調(diào)節(jié)特性使得MSCs在再生細(xì)胞治療中表現(xiàn)出巨大潛力。MSCs主要通過釋放外泌體(exosomes,Exos)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊,相較于合成納米材料,Exos不但降低了藥物清除率,在靶向性、安全性和藥代動(dòng)力學(xué)方面也更具有優(yōu)勢[3],推動(dòng)了納米載藥、基因工程等技術(shù)的發(fā)展,其作為一種新的無細(xì)胞治療策略逐漸受到研究者的關(guān)注。近年來的研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-Exos)在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用,這為干眼的治療提供了新的方向。

1 MSCs及Exos概述

MSCs是從多種組織中分離出來的一種多能成體干細(xì)胞,具有自我更新能力和向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞及其他類型細(xì)胞多向分化潛能[4]。因其相對簡單的細(xì)胞分離程序、自我更新和擴(kuò)展的潛力、低免疫原性、多能性和分泌支持組織更新或替代的介質(zhì)而逐漸成為最有前途的細(xì)胞治療工具之一。MSCs具有免疫調(diào)節(jié)潛能,可以調(diào)節(jié)固有和適應(yīng)性免疫細(xì)胞,在受到炎癥因子刺激后通過細(xì)胞間的相互作用及產(chǎn)生細(xì)胞因子發(fā)揮免疫重建功能。然而,有報(bào)道表明MSCs在受損組織區(qū)域的存活率低,移植潛力低,注射可能導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散,此外,MSCs分化可能導(dǎo)致動(dòng)物模型組織骨化或鈣化[5],這在一定程度上限制了MSCs的有效性。

Exos這個(gè)術(shù)語最早于1981年由Trams等[6]提出,直徑40-100 nm,密度1.13-1.19 g/mL[7]。Exos是一種雙層脂質(zhì)囊泡,產(chǎn)生于多囊體內(nèi),通過多囊體與質(zhì)膜的融合釋放到細(xì)胞外環(huán)境[8],具有包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞表面受體、酶、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和核酸[4]在內(nèi)的多種信號分子,其擁有良好的生物相容性、穩(wěn)定性、低毒性和分子交換能力,能夠跨越血腦屏障和血-眼屏障,通過多種途徑與靶細(xì)胞結(jié)合,將上述信號分子進(jìn)行細(xì)胞間傳遞,實(shí)現(xiàn)遺傳信息交換、宿主細(xì)胞重編程和細(xì)胞通訊,從而達(dá)到藥物傳遞的目的[3],主要機(jī)制包括內(nèi)吞作用、配體-受體結(jié)合或直接結(jié)合[9-11]。這些神奇的小囊泡在藥物傳遞、疾病診斷、細(xì)胞內(nèi)通訊和生物標(biāo)記物治療方面表現(xiàn)出的巨大潛力已逐漸成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

2 MSC-Exos的生物學(xué)功能及其制備

2.1MSC-Exos的生物學(xué)特性MSCs通過旁分泌途徑釋放Exos介導(dǎo)細(xì)胞間通訊,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。MSC-Exos作為細(xì)胞間載體能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)、RNA等重要生物活性物質(zhì)運(yùn)送到靶細(xì)胞中達(dá)到特定疾病途徑的調(diào)控,顯示出其通過藥物傳遞治療多種疾病的巨大潛能[12],MSC-Exos保持其免疫原性低的優(yōu)勢,無需擔(dān)心MSCs注射并發(fā)癥[13],降低了不良分化及成瘤的風(fēng)險(xiǎn)。此外,與它們的親代細(xì)胞相似,Exos的表面及內(nèi)部可以被修飾,并可以在其表面附著各種靶向分子來提高M(jìn)SC-Exos的靶向性,以顯示不同的抗體或表面受體,具有很強(qiáng)的擴(kuò)展性[14]。這使得MSC-Exos在疾病治療方面比MSCs細(xì)胞治療風(fēng)險(xiǎn)更小,應(yīng)用范圍更廣,已然成為無細(xì)胞治療的前途工具。因此,探究MSC-Exos在疾病中的作用及其機(jī)制有利于提升臨床疾病的診療水平。

2.2MSC-Exos的功能MSC-Exos具備分化、炎癥和免疫抑制等各種調(diào)節(jié)功能,在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究取得了很大進(jìn)展。MSC-Exos的抗炎作用依賴于在炎癥免疫細(xì)胞(M1巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD4+Th1和Th17細(xì)胞)中傳遞免疫調(diào)節(jié)miRNAs和免疫調(diào)節(jié)蛋白,使其表型轉(zhuǎn)化為免疫抑制的M2巨噬細(xì)胞、耐受性樹突狀細(xì)胞和T調(diào)節(jié)細(xì)胞,有助于減輕炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)再生[15]。MSC-Exos通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、促炎因子和抗炎因子的比例以及與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因[16-17],在免疫抑制中發(fā)揮重要作用。

2.3MSC-Exos的制備MSC-Exos的現(xiàn)存分離技術(shù)主要包括超速離心分離技術(shù)、沉淀技術(shù)、免疫親和捕獲技術(shù)以及一些新的組合技術(shù),其中通過超速離心技術(shù)所獲得的MSC-Exos 純度最高[18],該方法根據(jù)Exos的大小和密度分離,這種技術(shù)雖然耗時(shí),但成本較低且安全可靠,通常用于從大量生物培養(yǎng)物中分離Exos。然而,當(dāng)前各種方法都存在設(shè)備復(fù)雜、可擴(kuò)展性、提取囊泡純度控制、污染控制等局限性,從臨床前研究到臨床,MSC-Exos在大規(guī)模體外生產(chǎn)、高質(zhì)量收集、優(yōu)化儲存條件等方面仍存在挑戰(zhàn)。因此,當(dāng)前需要解決的主要問題是如何建立最佳的MSCs培養(yǎng)條件及Exos生產(chǎn)、分離和儲存的標(biāo)準(zhǔn),以提供批間的一致性、最佳劑量和給藥時(shí)間表。

3 MSC-Exos在干眼治療中的作用及機(jī)制

干眼是眼科最常見的慢性眼表疾病之一,是由淚液的質(zhì)、量及動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜不穩(wěn)定和高滲透壓的惡性循環(huán),導(dǎo)致眼表炎癥、損傷和神經(jīng)感覺異常,對患者的視覺功能、日常活動(dòng)及生活質(zhì)量都有顯著的影響[19]。在干眼治療中,MSC-Exos的治療目標(biāo)是再生新的組織,以修復(fù)角膜、結(jié)膜和其他炎癥引起的損傷,并恢復(fù)淚膜的穩(wěn)定性。Harrell等[20]通過對干眼患者使用人羊水來源MSCs(AF-MSCs)的滴眼液,顯著減輕了干眼患者的眼干、異物感、瘙癢感、疼痛、刺激、灼燒和眼疲勞,提示AFMSC-Exos在治療干眼中的治療潛力。以下將通過兩方面論述MSC-Exos對干眼治療作用的相關(guān)機(jī)制。

3.1MSC-Exos在炎癥方面對干眼的治療作用炎癥被認(rèn)為是干眼的主要致病因素之一。眼表對環(huán)境因素、感染、內(nèi)源性因素或抗原的應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是干眼的觸發(fā)機(jī)制,從而啟動(dòng)急性炎癥反應(yīng)的信號通路,包括刺激促炎細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和趨化因子的產(chǎn)生[21],使得自身反應(yīng)性輔助性T細(xì)胞擴(kuò)張,從而浸潤眼表和淚腺,最終導(dǎo)致眼表的進(jìn)一步損傷和一個(gè)自我持續(xù)的炎癥循環(huán)發(fā)展[22]。既往研究表明,干眼的長期炎癥可能導(dǎo)致白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β水平的改變[23-27],其中IL-6在干眼中表達(dá)尤其高,IL-6與受體結(jié)合后,可激活磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo),使Th17細(xì)胞分泌IL-17等炎癥因子[28],IL-17刺激MMP的表達(dá),破壞角膜屏障,導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡和杯狀細(xì)胞的丟失,從而加重炎癥和細(xì)胞凋亡。因此,控制炎癥是干眼治療的重要組成部分。

研究表明,Th1和Th17細(xì)胞同時(shí)存在于結(jié)膜杯狀細(xì)胞富集區(qū),并伴有IFN-γ和IL-17的高表達(dá)[29],抑制IFN-γ能顯著減少杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白,抑制Th17細(xì)胞功能或靶向IL-17可以顯著降低干眼的嚴(yán)重程度并延緩其進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),AF-MSCs可以產(chǎn)生高水平的IL-10以及免疫調(diào)節(jié)生長相關(guān)基因以減弱樹突細(xì)胞的成熟和抗原遞呈功能,抑制Th17的免疫應(yīng)答[30],從而表現(xiàn)出免疫抑制的能力。AFMSC-Exos含有免疫抑制因子TGF-β和HGF,可以抑制T細(xì)胞增殖并減弱T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。同樣,B細(xì)胞的成熟和增殖減少,其產(chǎn)生抗體的能力受到抑制,這表明AFMSC-Exos具有很強(qiáng)的免疫抑制潛能[31],證實(shí)了AFMSC-Exos作為一種潛在的炎癥性疾病治療新藥物的意義。

有研究證明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(ADSC-Exos) 可能通過抑制TLR4信號通路/NLRP3-IL-1β信號通路降低細(xì)胞因子從而對苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼具有顯著的治療作用[32-33]。李娟等[34]通過臍帶血MSC-Exos混懸液證明其能夠降低IL-6、IL-1β、TNF-α的轉(zhuǎn)錄,從而參與免疫系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié),達(dá)到治療干眼的目的。李娜等[35]通過建立兔自身免疫性干眼模型證明人臍帶來源MSC-Exos可誘導(dǎo)外周血單核巨噬細(xì)胞向抗炎性M2表型分化,抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá)分泌,同時(shí)升高TGF-β、IL-10 等表達(dá),以達(dá)到減輕干眼角膜上皮損傷的目的。

3.2MSC-Exos在神經(jīng)及組織修復(fù)方面對干眼的治療作用眼表感覺神經(jīng)異常或淚腺功能異常可能引發(fā)干眼。角膜是眼前段最外層的透明結(jié)構(gòu),表面密布著感覺神經(jīng),眼表微環(huán)境變化信號到達(dá)神經(jīng)中樞后,傳出神經(jīng)支配刺激眼表腺體分泌和眨眼反射。角膜神經(jīng)通過保護(hù)性眨眼反射和控制淚液分泌促進(jìn)上皮生長以及局部免疫調(diào)節(jié),構(gòu)成了眼表微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的支柱,其功能異常會破壞眼表微環(huán)境,從而加重眼表損傷,導(dǎo)致干眼相關(guān)炎癥的持續(xù)性。此外,正常的結(jié)膜神經(jīng)功能是調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞分泌和維持眼表功能的重要因素,結(jié)膜神經(jīng)功能異常會導(dǎo)致杯狀細(xì)胞分泌減少,從而影響淚膜穩(wěn)定性,加重眼表損傷。研究表明脂肪MSCs可以通過分泌神經(jīng)生長因子、腦源性及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子抑制炎癥反應(yīng),支持周圍神經(jīng)再生[36],局部應(yīng)用MSC-Exos可以顯著增加杯狀細(xì)胞的數(shù)量和分泌的質(zhì)量以治療干眼[37]。

淚液大部分由淚腺分泌,淚液分泌不足或成分異常及淚腺功能異常會引起干眼,從而出現(xiàn)眼部干澀、異物感、燒灼感等表現(xiàn)。淚腺來源MSC-Exos包含 Lcn2、prosaposin、Rac1和STAT1等蛋白,這些蛋白對淚腺上皮細(xì)胞存活產(chǎn)生積極影響,并可能誘導(dǎo)淚腺再生[38],體現(xiàn)MSC-Exos通過組織修復(fù)能力實(shí)現(xiàn)緩解干眼的目的。

總的來說,炎癥的惡性循環(huán)被認(rèn)為是干眼的核心驅(qū)動(dòng)因素,其眼表感覺神經(jīng)元和局部免疫系統(tǒng)之間的雙向相互作用導(dǎo)致淚液高滲、角膜和結(jié)膜細(xì)胞凋亡,進(jìn)而刺激神經(jīng)沖動(dòng)活動(dòng)[39]。了解與干眼相關(guān)的基本免疫因素對于適當(dāng)管理干眼患者至關(guān)重要,近年來研究表面MSC-Exos在炎癥反應(yīng)、藥物傳遞、神經(jīng)及組織方面顯示出具有巨大的潛力和可實(shí)用性,然而目前的研究大多建立在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,且制備困難,缺乏大樣本的臨床研究,包括給藥方式、劑量、治療時(shí)機(jī)、臨床試驗(yàn)的安全性及有效性等也有待于進(jìn)一步探索,這需要通過動(dòng)物研究進(jìn)一步驗(yàn)證和評估,否則無法在臨床上發(fā)揮MSC-Exos的治療潛力。

4展望

MSC-Exos在細(xì)胞通訊和免疫調(diào)節(jié)方面起著重要作用,可以促進(jìn)受損組織或細(xì)胞修復(fù)和再生、減輕炎癥及重建眼表穩(wěn)態(tài),作為藥物運(yùn)輸載體在干眼治療中表現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景,然而其在人體內(nèi)的生物分布、半衰期以及Exos與靶細(xì)胞溝通的分子機(jī)制等方面需要進(jìn)一步明確,此外,MSC-Exos治療干眼尚缺乏與其他疾病模型進(jìn)行對比研究的數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床研究,以證實(shí)其在干眼治療中的有效性、安全性,MSC-Exos在其他眼科治療如葡萄膜炎、腫瘤性疾病等方面研究尚屬空白。同時(shí),由于技術(shù)限制,難以獲得高純度、高得率的MSC-Exos,因此未來需要進(jìn)一步對Exos的生物發(fā)生、細(xì)胞攝取和運(yùn)輸?shù)阮I(lǐng)域以及眼部其他疾病進(jìn)行廣泛深入的研究。

近年來,隨著生物工程和細(xì)胞修飾技術(shù)的高速發(fā)展,Exos的下一步研究將是表面和內(nèi)容物的工程或修飾,以應(yīng)用到更加廣闊復(fù)雜的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。隨著研究思路與研究技術(shù)的不斷發(fā)展,MSC-Exos有望為干眼及其他眼部疾病的診斷與治療提供新策略,為此需要進(jìn)一步探索優(yōu)化上述問題,并促進(jìn)未來Exos的功能研究。