適宜施氮量提高東北黑土非共生固氮速率和固氮菌豐度

關鍵詞：免耕；施肥量；非共生固氮速率；土壤固氮微生物群落；nifH

氮（N）是植物需求量最大的元素，也是限制產量形成的最重要的營養元素[1?3]。人們普遍追求作物高產，而土壤氮庫通常不能滿足植物對氮的需求[4]。氮肥的過量使用，使土壤自身供氮能力的下降，破壞了農田生態系統的穩定性，嚴重影響了我國農業的可持續發展，加劇了生態環境的惡化[5]。生物固氮過程催化大氣中的氮氣還原為植物可利用的氮，每年可為農田生態系統提供40～70TgN輸入，是農業生態系統中重要氮來源之一[6?7]。生物固氮主要包括兩種類型：一是共生固氮，主要由與植物寄主共生的固氮微生物介導；二是非共生固氮，主要由異養、自養菌或某些固氮古菌介導。與共生固氮相比，非共生固氮速率低，但在時間和空間上分布廣泛，非共生固氮量約為每年N0～60kg/hm2，被認為是土壤生態系統中重要氮輸入源[8]。因此，非共生固氮作為一種環境友好、可持續的供氮方式，可以替代部分無機氮肥[9]，為農業生產中過量施氮造成的能源消耗和生態環境污染問題提供替代方案。

nifH基因是固氮菌中編碼鐵蛋白的基因，具有高度保守性，作為分子標記基因用于研究土壤固氮微生物多樣性和群落組成[10]。大量研究表明，土壤固氮微生物的豐度、多樣性以及活性受施肥管理和種植方式等多種因素的綜合影響[11?13]。長期定位施肥試驗研究發現，高量施用無機肥料（NPK）可能降低固氮微生物群落的豐度，改變固氮群落結構并抑制潛在的固氮能力[14?15]。肥料對土壤固氮菌群的影響主要體現在通過提供可利用營養物，如有機碳、磷、可利用氮，以及碳氮比的變化，直接影響固氮細菌，也可通過改變土壤性質間接影響固氮細菌[16?17]。結合宏基因組技術的研究表明，施用高量氮肥抑制了土壤非共生固氮效率，這可能是當土壤環境中存在較高水平的礦化態氮（NH4+或者NO3?）后，許多固氮微生物會自動關掉固氮功能。非共生固氮為農田生態系統氮素輸入的重要途徑，土壤有效態氮含量與固氮微生物nifH基因豐度及非共生固氮潛力密切相關。因此，了解不同施氮量下土壤固氮微生物群落及固氮速率的變化，能夠有效利用非共生固氮作用，最大程度上優化肥料施用量[18]。非共生固氮在黑土中的研究此前鮮有報道，關于秸稈還田保護性耕作下不同施氮量對土壤非共生固氮的影響也沒有開展系統研究。因此，本研究基于黑土保護性耕作長期定位試驗，采用乙炔還原法（測定非共生固氮速率）和高通量測序等技術，分析不同施氮量下土壤理化性質、非共生固氮速率、固氮微生物豐度、固氮菌群落多樣性和結構的變化規律，有助于更好地了解黑土長期施肥的生態效應，明晰固氮細菌在農業生態系統中的生態功能，從而促進生物固氮、降低無機氮肥的使用。

1材料與方法

1.1研究區概況

本試驗依托于吉林省長春市中國科學院東北地理與農業生態研究所長春綜合試驗站（44°00′N，125°24′E）的保護性耕作長期定位試驗。試驗區土壤類型為中層典型黑土，壤質粘土。試驗區氣候屬于中溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫6.4℃，年均降水量為550mm，降雨量主要集中在6、7、8月。定位試驗始于2012年。本研究的微區試驗選擇秸稈覆蓋全量還田的玉米連作免耕小區。除播種外，全年不擾動土壤，前茬秸稈覆蓋地表還田。采用聯合作業牽引式免耕播種機播種。

1.2微區試驗設計

微區試驗開始于2021年5月，設置不同施氮量。本試驗采用100%秸稈還田（秸稈還田量為11000kg/hm2），試驗中所用氮肥為尿素。為減少擾動，提前將18個高0.3m、邊長0.5m的正方形PVC框埋入試驗小區，并在上面罩一層紗網，避免秸稈被風吹走。根據東北地區農民習慣施氮量（240kg/hm2）及優化施氮量（150kg/hm2），試驗設置6個施氮量處理：0、120、150、180、210、240kg/hm2，分別記作N0、N120、N150、N180、N210、N240。每個處理3次重復，總計18個微區，隨機區組排列。5月16日同時進行播種與添加氮肥，各處理P2O5和K2O用量均為78kg/hm2。每個微區播種兩株玉米，播種深度為3～5cm，化肥施用量根據微區面積分成兩份，分別于兩株玉米側下方6～9cm處深施，與種子相隔3～5cm。

1.3土壤樣品的采集

于2021年7月末，采集0—5、5—20cm土層土壤樣品，每個小區呈“S”形取樣，7個采樣點，將同一深度的7個樣品混合成1個樣品帶回實驗室，測定含水量等基本數據。一部分土壤樣品在?80℃冰箱儲存，用于測定土壤固氮微生物；一部分土壤樣品在4℃冰箱保存，測定非共生固氮速率；另一部分土壤樣品自然風干后，用于測定土壤理化性質。

1.4測定方法

1.4.1土壤理化性質 土壤全量碳氮采用元素分析儀（FlashEA1112，ThermoFinnigan，Italy）測定；土壤微生物量氮（MBN）采用氯仿熏蒸提取，用TOCVCPH自動分析儀測定（日本島津）濾液氮含量；土壤無機氮采用全自動連續流動分析儀（SKALARSAN++，荷蘭）測定；有效磷采用連續流動分析儀（荷蘭SAN++SKALAR）測定；速效鉀采用GBC-906原子吸收光譜儀（澳大利亞AAS）測定。

1.4.2非共生固氮速率測定方法 土壤非共生固氮速率采用乙炔還原法（ARA）測定[19]。將10g新鮮土壤樣品置于密閉性良好的血清小瓶中，置于28℃～30℃培養箱中培養48h，在無菌條件下將血清小瓶瓶蓋換成橡膠塞，用無菌注射器抽出10%的氣體，每瓶注入1mLC2H2，再置于28℃～30℃下培養24～48h。48h內用氣相色譜儀測定待測氣體中C2H4生成量，具體做法是用無菌注射器從瓶中抽取0.2mL混合氣體注入氣相色譜儀（GC）進樣柱，測定C2H4含量，然后再換算成固氮速率。分析步驟如下：當高純He載氣以及空氣和氫氣的流量達到設定值時，打開GC開關，調用GC己設定好的方法，當柱箱溫度、檢測器溫度和進樣口溫度分別達到60℃、250℃和250℃時，開始點火；于Ailgent色譜在線工作站設置好實驗參數，待基線趨于穩定后進行樣品檢測；用進樣針抽取頂空氣體樣品1mL，進樣；待氣體樣品分組檢出后，依據本研究的保留時間（4.7min）找出乙烯組峰，可得出乙烯組的峰面積數值，通過外標法可校正得出相對應的氣體樣品乙烯濃度（含量）。乙烯產生量與固氮量最常用的摩爾比值是3∶1，即按C2H4∶N2=3∶1比例計算。

1.4.3DNA提取和PCR擴增 使用E.Z.N.A.?soilDNAkit試劑盒（OmegaBio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤總DNA，隨后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA提取質量，用NanoDrop2000微量分光光度計（ThermoScientific，USA）檢測其濃度和純度，?20℃保存備用。將提取的DNA原液稀釋至約10ng/μL作為PCR擴增模板。擴增引物為帶有16bp頭部序列的nifHF（5′?AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC?3′）和nifHR（5′?TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT?3′）。擴增程序：95℃預變性3min后，95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸60s，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用AxyPrepDNAGelExtractionKit（AxygenBiosciences，UnionCity，CA，USA）進行產物回收純化。利用Illumina公司的MiseqPE300/NovaSeqPE250平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。

1.4.4實時定量PCR qPCR采用ABI7900實時定量PCR系統進行檢測，選用的熒光試劑是SYBRPremixExTaqTMⅡ。擴增引物是ploF（TGCGAYCCSAARGCBGACTC）和polR（ATSGCCATCATYTCRCCGGA），擴增體系為15μL，包含7.5μL2×SYBRPremixExTaqII，0.3μL50×ROXReferenceDye，10μmol/L的前后引物各0.6μL，2μLDNA模板和4.0μLddH2O，每個樣品3次重復。擴增程序為95℃預變性30s，95℃解鏈5s，62℃退火30s，72℃延伸60s，83℃采集信號10s，40個循環。梯度稀釋標準質粒同時進行熒光定量PCR擴增，計算nifH基因的豐度．

1.5數據分析

生物信息學分析等由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成，原始數據下機后，首先進行數據質控，通過序列拼接、過濾和去嵌合體后得到優化序列，使用UPARSE軟件（http：//drive5.com/uparse/，version7.1），根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。比對Silva16SrRNA數據庫（v138），設置比對閾值為70%。

基于Chao1指數和Simpson指數描述固氮菌群落的α多樣性。不同處理的Chao1指數和Simpson指數差異采用One-wayANOVA方法分析，用SPSS軟件（version24.0，IBM，USA）完成統計。土壤固氮菌的群落結構用unweighted-unifrac的PCoA分析，nifH基因的拷貝數、多樣性與土壤理化性質的相關性采用Pearson分析。采用Excel2016對試驗數據進行整理。利用SPSS軟件對數據進行統計分析。

2結果與分析

2.1不同施氮量下土壤非共生固氮速率和nifH基因豐度

從不同施氮量處理下非共生固氮速率（圖1）可以看出，隨施氮量的增加，0—5和5—20cm土層土壤非共生固氮速率先增加，在N150處理達到最大，之后降低，在N210處理下最低。0—5cm土層，N150處理的非共生固氮速率除與N180處理差異不顯著外，與其他處理差異均顯著（Plt;0.05）；5—20cm土層，N150處理與N120、N180處理無顯著差異，與其他處理差異顯著。不同施氮量處理下，土壤的非共生固氮速率為C2H40.26～0.63nmol/（g·d），N150處理0—5和5—20cm土層非共生固氮速率分別為0.53和C2H40.63nmol/（g·d）。由圖2可知，0—5cm土層土壤固氮基因豐度范圍是5.34×106～15.64×106copies/g，隨著施氮量的增加，固氮基因豐度呈上升趨勢，在N150處理達到最大值，N150處理的固氮基因除了與N120處理差異不顯著外，與其他處理均差異顯著（Plt;0.05）。在5—20cm土層，隨著施肥量的增加，固氮基因豐度呈先下降再上升再下降趨勢，在N150處理達到最大值，為8.74×106copies/g，而后隨著施肥量的增加而降低，N150處理的固氮基因豐度與N0、N180、N210處理差異不顯著，與其他處理差異顯著（Plt;0.05）

2.2不同施氮量下固氮微生物群落多樣性及群落組成

由表1可知，0—5和5—20cm土層的土壤固氮微生物Shannon指數各處理間差異均不顯著。不同施氮量下土壤固氮微生物豐富度（Chao）指數差異顯著，在N150處理達到最大值，之后隨著施氮量的增加先降低再升高。N150處理與N210處理0—5cm土層土壤固氮微生物chao指數差異不顯著，與其他處理差異顯著。N150處理5—20cm土層土壤固氮微生物chao指數與N0、N240處理差異不顯著，與其他處理差異顯著。

采用加權（weighted-unifrac）算法對不同施氮量下固氮微生物群落結構進行主成分分析（圖3），第一主成分和第二主成分分別解釋了總體變化的26.39%和12.88%，兩者總解釋率為39.27%。Adonis（R=0.0428，Plt;0.05）分析表明，不同施氮量處理間固氮微生物群落結構存在顯著差異。

從不同施氮量下固氮菌群屬水平的相對豐度（圖4）來看，0—5cm土層，unclassified_o_Burkholderiales、unclassified_k_norank_d_Bacteria、斯克爾曼氏菌（Skermanella）為優勢菌屬，N150處理Skermanella的豐度最大。5—20cm土層，以unclassified_o_Burkholderiales、unclassified_k_norank_d_Bacteria、甲基孢囊菌屬（Methylocystis）為優勢菌屬，N150處理unclassified_o_Burkholderiales和unclassified_k_norank_d_Bacteria的豐度最大。

2.3相關性分析

從不同施氮量下土壤環境因子與固氮微生物群落相關指標的Spearman相關性分析結果（表2）可知，非共生固氮速率與pH呈顯著負相關（r=?0.511，Plt;0.05），與速效鉀呈顯著正相關（r=0.522，Plt;0.05）。nifH基因拷貝數與施氮量呈顯著負相關（r=?0.519，Plt;0.05），與速效鉀呈顯著正相關（r=0.604，Plt;0.05）。為了進一步探究不同施氮量下影響nifH基因群落結構的環境因子，進行了冗余分析（redundancyanalysis，RDA）。如圖5所示，RDA1的變異解釋率為22.98%，RDA2的變異解釋率為4.79%，總變異解釋率為27.77%。nifH群落結構與土壤pH、NH4+-N、NO3?-N、有機碳、全氮、有效磷、速效鉀呈顯著相關（Plt;0.05）。

3討論

3.1不同施氮量對土壤非共生固氮速率和nifh基因豐度的影響

本研究結果顯示，不同施氮量下，非共生固氮速率及nifH基因豐度的最大值出現在N150處理，并不隨著施氮量的增加持續增大。有研究也指出，高氮輸入會降低生態系統對非共生固氮菌的依賴性，抑制固氮效果[20]。增加氮肥用量會降低非共生固氮速率和nifH基因拷貝數；施用氮肥不僅降低了根際土壤固氮菌占總細菌的比例，也顯著降低了固氮酶的活性；也有研究表明，向土壤持續輸入氮肥40年后，固氮速率下降50%，固氮菌群落的優勢類群相對豐度發生了顯著變化。這均和本研究結果一致。當外源氮進入土壤時，微生物可以提高纖維素水解酶（如β-1，4-葡萄糖苷酶和纖維素二糖水解酶等）的活性，導致纖維素、半纖維素等可被利用的碳源物質越來越少，有效碳源的減少不僅使固氮微生物的生理代謝受到影響，還會阻礙其生物固氮的過程[21?22]。長期的氮素輸入，提高了土壤的氮素含量和生物總量，增加了微生物之間的競爭[23?24]，此時繼續通過耗能方式進行固氮將不利于固氮菌的生存，固氮菌的數量也會逐漸減少[25]。長期施用氮肥增加了土壤固氮基因擴增的難度，從而抑制固氮基因的表達。此外，有些固氮菌對高氮環境的耐受性較弱，長期的氮輸入可能不利于這些固氮菌的生存，從而降低了固氮菌的群落豐度[26]。結合本研究團隊在東北黑土區典型縣域多年的生產實踐和田間調查也發現，150kg/hm2在發揮肥效與促進作物生產協同方面效果最佳，可以作為最適參考施氮量。

3.2不同施氮量對土壤固氮微生物群落多樣性及群落結構的影響

農田生態系統中，土壤固氮微生物參與土壤氮循環利用，其群落結構的多樣性對農田土壤氮素的固持和循環利用具有重要意義[27]。本研究表明，不同施氮量改變了土壤固氮微生物多樣性及群落結構。原因主要有兩方面：一是，長期施肥對土壤理化性狀（如土壤pH、養分有效性、碳的質量及儲量等）的改變以及植物生長，都會直接或間接重塑土壤微生物群落組成和結構[28?30]；二是，農田長期施用氮肥會降低土壤固氮微生物的競爭力，從而導致其群落結構、組成和多樣性的改變[31?33]。施肥對固氮微生物多樣性和結構有顯著的影響，但是影響效果目前還沒有得到完全一致的結論。Martensson等[34]研究發現，施用氮磷鉀肥對固氮微生物的影響較小。也有研究指出，施肥對表達nifH基因的微生物影響甚微，不同施肥量下施肥土壤nifH的mRNA數量和DNA拷貝數并未發生明顯變化[35]。不同研究獲得了不一致結論的原因，可能是由于施肥后引起了土壤碳、pH、可利用氮等的改變，其他因素如作物、土壤濕度、土地利用方式和土壤類型等不同，也會導致肥料對固氮菌群落影響效果不同[36]。

3.3東北黑土固氮菌群落結構受多個土壤性質指標共同影響和調控

微生物群落結構的形成是一個復雜的過程，需要多個土壤變量的協同作用。高氮輸入的有效性直接影響微生物群落結構。本研究中，非共生固氮速率與速效鉀（AK）呈顯著正相關，與pH呈負相關。nifH基因拷貝數與AK呈顯著正相關，與施氮量呈負相關。nifH基因群落結構受土壤pH、NH4+-N、NO3?-N、土壤有機碳、全氮（TN）、有效磷（AP）、AK的影響顯著。眾多研究表明，固氮微生物群落結構對不同施肥量反應敏感，這可能是由于不同施肥模式下土壤理化性質發生改變引起的[15，36]。在其他研究中也觀察到，與氮有關的土壤特性（包括NH4+-N、NO3?-N和TN）是影響土壤固氮群落結構的最主要因素[16]。此外，土壤AP和AK是另外兩個重要因素。因此，土壤養分有效性（取決于肥料提供的元素）對固氮群落結構的形成至關重要。何冬華等[37]也研究表明，不同施肥量下土壤理化性質對固氮菌群落的影響較為顯著，進一步說明東北黑土固氮菌群落結構由多個土壤性質指標共同影響和調控。不同施氮量導致土壤理化性質的變化是土壤微生物群落變化的主要原因。因此，農田生態系統不同的氮肥用量改變了土壤的理化性質，從而影響土壤固氮速率、nifH基因豐度及群落結構。

4結論

非共生固氮速率及nifH基因豐度的最大值出現在N150處理，且并未隨著施氮量的增加持續增大，說明高氮輸入會降低生態系統對非共生固氮菌的依賴性，抑制固氮效果。不同施氮量處理改變了土壤理化性質、固氮微生物多樣性及群落結構。非共生固氮速率與全鉀含量呈顯著正相關，與pH呈負相關。nifH基因拷貝數與全鉀含量呈顯著正相關，與施氮量呈負相關。不同施氮量引起的土壤pH、NH4+-N、NO3?-N、有機碳、全氮、全磷、全鉀的變化，是調控固氮微生物群落結構變化的主要因子。由此可見，免耕耕作方式下，150kg/hm2是增加土壤非共生固氮速率和固氮微生物豐度的適宜施肥量。